古細菌における分子シャペロンシステムの機能

Research Project

Project/Area Number	11153206
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Tokyo University of Agriculture and Technology
Principal Investigator	養王田正文東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	吉田尊雄海洋バイオ研究所, 釜石研究所, 研究員
Project Period (FY)	1999
Project Status	Completed (Fiscal Year 1999)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 1999: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Keywords	分子シャペロン / シャペロニン / 古細菌 / 超好熱菌 / フィラメント / プレフォルディン / sHsp / Thermococcus'
Research Abstract	超好熱性古細菌 Thermococcus strain KS-1 由来シャペロニンのα,βサブユニットは非常に高い相同性を有しているが,C末端のみ相同性が低い.このC末領域のペプチドを抗原として,各サブユニットに特異的な抗体を作成し,Western Blotting及びELISAにより,菌体内における各サブユニットの量を定量した.その結果,Thermococcus菌体内のシャペロニンでは,生育温度によりオリゴマーのサブユニット組成が異なり,αとβサブユニットのそれぞれが個別に発現制御されていることを明らかにした.αの発現は構成的であり,高温でも発現量は変化しない.一方,βは至適生育温度前後ではαよりも少ないが,温度が上がるに従って発現量が多くなった.また,αホモオリゴマーとβホモオリゴマーの結晶化を試み,αホモオリゴマーの結晶が得られた. T.KS-1のsHspを大腸菌で生産し,その特性を調べた.組換えT.sHspは精製が不十分な状態ではタンパク質の変性中間体に結合する活性はほとんどなかったが,精製度を上げると活性が確認され,Thermoplasma由来Citrate synthaseの熱変性による凝集を防いだ.T.sHspはホモオリゴマーを形成し,その分子量を光散乱法により測定したところ478.6kDaであった.塩基配列から予想されたモノマーの分子量は20kDaであることから24量体であることが予想された.Methanococcus jannashiiのsHspは、結晶構造解析の結果,24量体のサッカーボール型であることが分かっているが,T.sHspも同様な構造を形成していることが示唆される.電子顕微鏡による解析結果もサッカーボール型であることが支持している. また,Pyrococcus horikoshii OT3の2つのPrefoldin遺伝子を大腸菌に組み込む,発現系を構築した.