モーター蛋白質アクトミオシンの結晶化とX線とESRによる分子構造解析

Research Project

Project/Area Number	11156218
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	荒田敏昭大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (70151165)
Project Period (FY)	1999
Project Status	Completed (Fiscal Year 1999)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 1999: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	アクチンモノマー / 非重合アクチン / ミオシンヘッド / アクトミオシン / X線小角散乱 / 電子スピン共鳴 / 結晶解析 / スピンラベル
Research Abstract	我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチン単、2量、3量体とミオシン頭部の複合体のX線散乱実験とモーター蛋白用にESR精密角度計測を行った。Gアクチンを化学修飾し、全く重合しないがミオシンと結合するアクチンモノマーを調製し、ミオシン頭部S1との1:1複合体を形成させ、複合体のみの散乱強度曲線を得ることに成功していた。アクチン、S1の原子座標を用いて全散乱強度曲線を最適化するドッキング原子モデルを計算機により探索したところ、我々の電顕写真観察で予想されるように、S1先端近くにアクチンが結合することが確定した。ADP中でも解離を最小限に抑えた条件で同様の実験することに成功し、分子量は変わらず慣性半径が約3-4オングストロームだけ小さくなった。モデル計算ではS1が長軸のまわりに90度以上回転した。この結果はATP加水分解中のアクチン-ミオシンの弱い結合の本体を捉えたものと考えれた。今年度はアクチン2量体、3量体を作成し、さらに高次の構造を解析した。重合しない2量体、3量体ともKI中の化学修飾で得られた。低イオン強度ではモノマーと同様1:1複合体を形成し、2:2、3:3複合体ができた。一方90mMKClでは2:1、3:1複合体ができた。また複合体形成によるATP分解促進やATPによる結合強度の変化も認められなかった。90mMKCIにおける2:1または3:1複合体のX線散乱実験も成功し解析を始めた。アクチン・ミオシン複合体モノマーの結晶化も精力的に押し進めているがまだ成功には至っていない。モーター蛋白用高感度ESR測定のためループギャップ共振器を試作し、コンピューター信号処理システムによりスペクトルを記録し引続き調整中である。最近はミオシンネック軽鎖に結合したスピンラベルのESRスペクトルを頭部2つから由来するスペクトル和として精密fitした。その結果弛緩状態でもミオシン頭部は2方向に緩く配向していると考えられる。