| Project/Area Number |
11167248
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
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| Project Period (FY) |
1999 – 2000
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2000)
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| Budget Amount *help |
¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Fiscal Year 2000: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 1999: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | 酵素免疫測定法 / 抗原抗体反応 / 分子シンクロナイゼーション / 臨床分析 / 酸化還元反応 / アルカリホスファターゼ / テトラゾリウム / C反応性蛋白質 / 臨床診断 / 酵素反応 / 酵素活性 / 補酵素 / ダイオキシン / 分析化学 |
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| Research Abstract |
酵素免疫測定法にカップルして、検出感度を増幅できる3酵素シンクロナイゼーション系の開発を検討した。alkaline phosphatase(ALP),alcohol dehydrogenase(ADH),diaphorase(DIA)の3酵素が効率よく作用するための条件を最適化した。DIAは不安定であり、適用できる温度、pH条件が狭いため、DIAの代わりに電子メディエータPMSを用いて再検討したところ、DIAより安価で、安定した触媒活性が得られた。DIAおよびPMSの基質としては、従来、INT(不溶性テトラゾリウム)が使用してきたが、不溶性の生成物フォルマザンが感度低下をもたらすため、今回、可溶性テトラゾリウム(WST-1)に変更した。WST-1を用いることにより、反応時間は30分から200分までのばすことができた。また、ALPの基質であるNADP+中に約0.1%のNAD+の混入が認められ、このことがバックグラウンドの原因となることが示された。HPLCによりNADP+を精製したところ、バックグラウンドを1/10に低減させることができた。ヒトのC反応性蛋白質(CRP)を抗原とするサンドイッチ酵素免疫測定法に、今回開発したシンクロナイゼーション系をカップルさせたCRP検出系を開発した。60分の反応で、50attomoleのCRPが検出可能であることが示された。本検出感度は臨床的に充分適用可能な感度である。p-ニトロフェニルホスフェートを基質とする従来法(1酵素系)に比べて、1000倍以上高感度であった。今後、ADH中にコンタミしているALPを除去することにより、より高感度化が期待される。
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