タバコネクロシスウィルスの高分解能立体構造と粒子形成機構の解析

• Project/Area Number: 11169223
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 福山 恵一 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80032283)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大岡 宏造 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (30201966) ; 佐伯 和彦 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (40201511) ; 角田 佳充 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (00314360)
• Project Period (FY): 1999 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥27,000,000 (Direct Cost: ¥27,000,000); Fiscal Year 2002: ¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000); Fiscal Year 2001: ¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000); Fiscal Year 2000: ¥9,700,000 (Direct Cost: ¥9,700,000); Fiscal Year 1999: ¥11,100,000 (Direct Cost: ¥11,100,000)
• Keywords: タバコネクロシスウイルス / タンパク質の4次構造 / X線結晶解析 / 粒子の再構成 / 立体構造 / 球状ウイルス / ウイルス粒子の再構成 / 4次構造 / アセンブリー機構 / ウイルスの立体構造 / 粒子の再機成 / 蛋白質間相互作用 / コート蛋白の限定分解 / コート蛋白の一次構造 / 蛋白間相互作用

Research Abstract

タバコネクロシスウィルス(TNV)は一本鎖RNAをゲノムとして持つ球状ウィルスであり、アガサ・ナス・マメ・ユリ科などの植物に感染し、壊疽症状を起こす。TNVのサブユニットは276アミノ酸残基からなる一次構造上一種類のタンパクであるが、これが180個集合してT=3の正20面体対称を持つキャプシドを形成している。TNV粒子はN末端領域の立体構造が異なる3種類のサブユニットから構成されていることを既に明らかにしている。さらにサブユニットの境界にCa^<2+>イオンがあり、EDTA処理により粒子は解離し、またCa^<2+>の添加により元の粒子と区別できない粒子に再構成することも明らかにしている。本研究では、N末端が粒子形成にどのように影響するか、さらにその構造基盤を明らかにすべく解析を進めた。まずN末端を欠いたサブユニットををコードする遺伝子の発現系を構築し、大腸菌で大量発現させた。このタンパク質は不溶性画分に得られたので、これを尿素で可溶化した後、尿素を除くことでリフォールドさせた。このタンパク質はCa^<2+>存在下で天然の粒子より小さな粒子に再構成した。この粒子の形・サイズから正20面対称的に60個会合したと考えられる。この粒子の立体構造解析のため、結晶化を試みたところ、約0.2mmの大きさの単結晶を得た。この結晶は正方晶系に属し、単位格子中に4粒子含まれる。放射光を用いたX線回折実験で、2.7Å以上の分解能の回折点を観測できた。数百万の回折強度データを収集し、現在これに基づいて構造解析中である。

Research Products

• [Publications] Atsushi Yamagata: "The crystal structure of exonuclease RecJ bound to Mn^<2+> ion suggests how its characteristic motifs are involved in exonuclease activity"Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 99・(9). 5908-5912 (2002)
• [Publications] Masakazu Sugishima: "Crystal Structure of Rat Apo-Heme Oxygenase-1 (HO-1) : Mechanism of Heme Binding in HO-1 Inferred from Structural Comparison of the Apo and Heme Complex Forms"Biochemistry. 41・(23). 7293-7300 (2002)
• [Publications] Yoshimitsu Shimomura: "Overproduction, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a quinone oxidoreductase from Thermus thermophilus HB8"Acta Crystallographica. D58. 1365-1367 (2002)
• [Publications] Masakazu Sugishima: "Crystal Structure of Rat Heme Oxygenase-1 in Complex with Heme Bound to Azide"J. Biol. Chem.. 277・(47). 45086-45090 (2002)
• [Publications] Kazuhiko Saeki: "Primary Structure and Phylogenetic Analysis of the Coat Protein of a Toyama Isolate of Tobacco Necrosis Virus"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 65・3. 719-724 (2001)
• [Publications] Yoshimitsu Kakuta: "Crystal Structure of Escherichiacoli Fdx, an Adrenodoxin-Type Ferredoxin Involved in the Assembly of Iron-Sulfur Clusters"Biochemistry. 40. 11007-11012 (2001)
• [Publications] Keiichi Fukuyama: "Atomic Resolution Structures of Oxidized [4Fe-4S] Ferredoxin from Bacillus thermoproteolyticus in Two Crystal Forms : Systematic Distortion of [4Fe-4S] Cluster in the Protein"J. Mol. Biol.. 315. 1155-1166 (2002)
• [Publications] Yutaka Oda: "Crystal Structure of Tobacco Necrasis Virus at 2.25Å Resolution"Journal of Molecular Biology. 300. 153-169 (2000)
• [Publications] Kazuhiko Saefei: "Primary Structure and Phylogenetic Analysis of the Coat Protein of a Toyama Isolate of Tobacco Necrosis Virus"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65・3. 719-724 (2001)