| Project/Area Number |
11240205
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Beppu University (2003)
大分医科大学 (1999-2002) |
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Principal Investigator |
山本 俊輔 別府大学, 食物栄養学部, 教授 (90040188)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松浦 恵子 大分大学, 医学部, 助手 (00291542)
泥谷 直樹 大分医科大学, 医学部, 助手 (80305036)
樋口 安典 大分医科大学, 医学部, 助教授 (60040284)
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| Project Period (FY) |
1999 – 2003
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
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| Budget Amount *help |
¥42,000,000 (Direct Cost: ¥42,000,000)
Fiscal Year 2003: ¥7,000,000 (Direct Cost: ¥7,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥7,400,000 (Direct Cost: ¥7,400,000)
Fiscal Year 2001: ¥9,800,000 (Direct Cost: ¥9,800,000)
Fiscal Year 2000: ¥8,000,000 (Direct Cost: ¥8,000,000)
Fiscal Year 1999: ¥9,800,000 (Direct Cost: ¥9,800,000)
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| Keywords | ADAM15 / バリアント蛋白 / Lck / Hck / Src / T細胞活性化 / ADAM6 / shedding / ADAMファミリー / スプライスバリアント / Srcファミリー / ADAM8 / CD156 / アポトーシス / メタロプロテアーゼ / ジスインテグリン / トランスジェニック / ADAM17 / TACE / ADAM / 単クローン抗体 / AD56 |
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| Research Abstract |
ADAM15:ヒトADAM15のバリアント:細胞内ドメインに25個とそれに続く24個計49個のアミノ酸の挿入配列を持つADAM15v1とADAM15v2を見出した。この細胞内配列はプロリンに富むクラスIIおよびクラスIのSH3結合配列から成り、ADAM12の細胞内ドメインのそれに酷似するが、ADAM15v2はこの配列をタンデムに持つことからより強力な構造である。このバリアントmRNAはT細胞およびマクロファージに強く発現している。ADAM15v2のSH3結合配列に対する単クローン抗体(mAb)を作成し、免疫沈降法でバリアント蛋白の発現を確認した。マウスのADAM15遺伝子の全塩基配列を決定し、イントロン19内に同様のバリアントが存在することを確認した。マウスのADAM15v2は24個のSH3結合配列はクラスIIの1個のコンセンサス配列の違いから、クラスIのみの配列である。ヒトおよびマウスのADAM15v2とSrcファミリー蛋白との結合性や結合度をADAM15のそれと比較検討するために、Lck、Hck-GST蛋白、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2HIS蛋白を作成しプルダウン法および免疫沈降法でADAM15v2がより強く、また、燐酸化蛋白がより強く反応することを確認した。さらに、非燐酸化および燐酸化ADAM15およびADAM15v2GST蛋白を作成し,抗LckあるいはHck抗体を用いてJurkat細胞やHL60細胞のLckあるいはHckが燐酸化ADAM15v2により強く反応することを確認した。また、マウスのEL4細胞では類似の方法で燐酸化LckおよびSrcが強く反応することを確認した。また、JurkatやEL4細胞をミリスチン酸や抗CD3抗体刺激で燐酸化ADAM15v2により強く反応することを観察した。Jurkat細胞では抗CD3抗体刺激でLFA-1とICAM-1の結合が亢進するが、この反応がBioporterを用いた抗ADAM15v2mAbの細胞内注入により阻害されることを確認した。(2)ADAM8(CD156):ADAM8のstabl transfectantを293T細胞に作成し、これに、TNF-α,HB-EGF,L-selectin,FasL,CD44などをtransient transfectし、免疫沈降法でTNF-αおよびHB-EGFが遊離されること(shedding)を確認した。TNF-αでは遊離をELISA法でも確認した。細胞内ドメインにはクラスIIおよびクラスI配列が存在し、これらにHckやLckが強く反応することを観察した。
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