蛋白質の核―細胞質間輸送の可視化

• Project/Area Number: 11242203
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research (2002-2003); National Institute of Genetics (2000-2001); Osaka University (1999)
• Principal Investigator: 今本 尚子 独立行政法人理化学研究所, 細胞核機能研究室, 主任研究員 (20202145)
• Project Period (FY): 1999 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥73,200,000 (Direct Cost: ¥73,200,000); Fiscal Year 2003: ¥14,500,000 (Direct Cost: ¥14,500,000); Fiscal Year 2002: ¥14,500,000 (Direct Cost: ¥14,500,000); Fiscal Year 2001: ¥12,700,000 (Direct Cost: ¥12,700,000); Fiscal Year 2000: ¥15,300,000 (Direct Cost: ¥15,300,000); Fiscal Year 1999: ¥16,200,000 (Direct Cost: ¥16,200,000)
• Keywords: 核-細胞質間輸送 / 核膜孔複合体 / 輸送担体 / importinβ / 蛍光1分子イメージング / 低分子量GTPase Ran / 核局在化シグナル / 一分子イメージング / 核蛋白質輸送 / importin α / importin β / 分子イメージング / importinα

Research Abstract

セミインタクト細胞を用いたin vitro輸送系において、輸送反応中のGFP-importinβ(輸送担体)とGST-NLS-GFP(輸送基質)1分子の挙動を、アセンブルした核膜孔複合体上で直接捉えることに成功している。輝点の寿命と蛍光強度の定量的解析より、輸送反応中に分子が核膜孔複合体上に滞在する時間及び1つの核膜孔複合体がimportinβを結合しうる分子数とimportinβに対する結合定数を求めた結果、以下の知見を得た。1)核膜孔複合体上には、importinβに対して数pmolオーダーの極めて強い少数の結合サイトと、およそ70nMオーダーの100〜200の多数の結合サイトが存在する。2)importinβ単独(基質とRan非存在下)では、核膜孔複合体上に短く滞在するもの(約1s)と、長く滞在するもの(約6〜10s)が見られるので、上記1)の両結合サイトと相互作用すると考えられる。3)importinβ/基質複合体(Ran非存在下)は短く滞在するもの(約1s)のみが見られ、核膜孔複合体上の弱い結合サイトのみと相互作用すると考えられる。4)importinβ/基質複合体(Ran存在下)は短く滞在するもの(約1s)と長く滞在するもの(約3s)がみられたが、長い滞在時間はimportinβ単独の滞在時間よりも短かった。1分子解析と同条件下において、輸送担体と輸送基質が核に集積する速度を求めたところ、輸送担体と基質ともに、長い滞在時間と核内集積速度が一致することが判明した。このことから、輸送担体が核膜孔複合体上の強い結合サイトに相互作用することが通過反応に重要であると考えられる。また、Ranの影響で滞在時間の変化が見られることから、強い結合サイトの性質がRanの影響で変化すると予想される。これら一連の結果は、一分子可視化技術を応用して得られた最初の知見であり、研究成果は十分に得られたと思われる。

Research Products

• [Publications] Soo Jae Lee: "The accommodation of asymmetric dimmer transcription factor by importin β"Science. 302. 1571-1575 (2003)
• [Publications] Maiko Furuta: "Heat-shock induced nuclear retention and recycling inhibition of importin α"Genes Cells. (in press). (2004)
• [Publications] 今本 尚子: "核-細胞質間輸送の分子機構と輸送経路の多様性"実験医学. Vol.21No.14. 1842-1849 (2003)
• [Publications] 今本 尚子: "細胞内輸送研究-細胞と個体形成の秩序を知る"実験医学. Vol.21No.14. 1836-1841 (2003)
• [Publications] 小瀬 真吾: "核膜孔複合体と核-細胞質間輸送"蛋白質核酸酵素. (印刷中). (2004)
• [Publications] 今本 尚子: "シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社"核膜孔複合体の分子構築とダイナミクス(印刷中). (2004)
• [Publications] 今本尚子: "核膜孔複合体:謎の多い核-細胞質間分子流通の場"実験医学. 6 (2002)
• [Publications] 小瀬真吾: "核-細胞質間タンパク質輸送の基本メカニズム"実験医学. 6 (2002)
• [Publications] Jiang C.-J.: "Molecular Cloning of a Novel Importin α Homologue from Rice, by which constitutive photomorphogenic 1 (COP1) nuclear localization signal (NLS)-protein is preferentially nuclear imported"J. Biol. Chem.. 276. 9322-9329 (2001)
• [Publications] Lee,S.J.: "The adoption of a twisted structure of importin β is essential for the protein-protein interacion required for nuclear transport."J.Mol.Biol.. 302. 251-264 (2000)
• [Publications] Tachibana,T.: "Recycling of importinα from nucleus is suppressed by loss of RCC1 function in living mammalian cells."Cell Struct.Funct.. 25. 115-123 (2000)
• [Publications] Matsubae,M.: "Characterization of the nuclear transport of a novel leucine-rich acidic protein-like protein."FEBS Left.. 468. 171-175 (2000)
• [Publications] Haraguchi,T.: "Reformation of the functional nuclear envelope during telophase : Tenporal sequences determined by fluorescence imaging in living Hela Cells."J.Cell Sci.. 113. 779-794 (2000)
• [Publications] Imamoto,N.: "Diversity in nucleocytoplasmic transport pathways"Cell Struct.Funct.. 25. 207-216 (2000)
• [Publications] 今本尚子: "蛋白質・核酸酵素"共立出版. 9 (2000)
• [Publications] 今本尚子: "バイオサイエンスの新世紀第2巻「タンパク質の一生」"共立出版. 15 (2000)
• [Publications] Kose, S.: "β-Subunit of nuclear pore-targeting complex (importin-β) can be exported from the nucleus in a Ran-independent manner"J. Biol. Chem.. 274. 3946-3952 (1999)
• [Publications] Hieda, M.: "A monoclonal antibody to the C-terminal acidic portion of Ran inhibits both the recycling of Ran and nuclear protein import in living cells"J. Cell Biol.. 144. 645-655 (1999)
• [Publications] Yokoya, F.: "β-Catenin can be transported in to the nucleus in a Ran-unassisted manner"Mol. Biol. Cell. 10. 1119-1131 (1999)
• [Publications] Nagoshi, E.: "Nuclear import of sterol regulatory element-binding protein-2, a basic helix-loop-helix-leucine zipper (bHLH-Zip)-containing transcription factor occurs through the direct interaction of importin β with HTH-Zip"Mol. Biol. Cell. 10. 2221-2233 (1999)
• [Publications] Sahara, S.: "Acinus, a caspase-3-activated protein responsible for apoptotic chromatin condensation"Nature. 401. 168-173 (1999)
• [Publications] Ohshima, T.: "CRM1 mediates nuclear export of nonstructural protein 2 from parvovirus minute virus of mine"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 264. 144-150 (1999)
• [Publications] Kose, S.: "Distinct energy requirement for nuclear import and export of importin β in living cells"FEBS Lett.. 463. 327-330 (1999)
• [Publications] Haraguchi, T.: "Live fluorescence imaging reveals early recruitment of emerin, LBR HP1β and RanBP2 to reforming functional nuclear envelope"J. Cell Sci.. 113. 779-794 (2000)
• [Publications] Matsubae, M.: "Characterization of the nuclear transport of a novel leucine-rich acidic nuclear protein-like protein"FEBS Lett.. (in press).
• [Publications] Tachibana, T.: "Recycling of importin α from the nucleus is suppressed by loss of RCC1 fuction in living mammalian cells"Cell Struct Funct.. (in press).
• [Publications] 小瀬真吾: "実験医学"羊土社. 7 (1999)
• [Publications] 横屋史彦: "秀潤社"細胞工学. 7 (1999)