DNA・タンパク質相互作用の1分子イメージングと計測

• Project/Area Number: 11242204
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research (2001-2003); Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience (2000); Keio University (1999)
• Principal Investigator: 原田 慶恵 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (10202269)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 船津 高志 早稲田大学, 理工学部, 教授 (00190124)
• Project Period (FY): 1999 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥98,100,000 (Direct Cost: ¥98,100,000); Fiscal Year 2003: ¥18,700,000 (Direct Cost: ¥18,700,000); Fiscal Year 2002: ¥18,700,000 (Direct Cost: ¥18,700,000); Fiscal Year 2001: ¥17,000,000 (Direct Cost: ¥17,000,000); Fiscal Year 2000: ¥21,200,000 (Direct Cost: ¥21,200,000); Fiscal Year 1999: ¥22,500,000 (Direct Cost: ¥22,500,000)
• Keywords: 生物物理 / 分子モーター / 1分子計測 / 可視化 / 酵素反応 / DNA / タンパク質 / RNAポリメラーゼ / イメージング / 顕微鏡 / 転写

Research Abstract

DNAの相同組み換えの過程において十字型構造をしたHolliday構造DNAが形成され、この十字型分岐点の移動により組み換えが進行する。分岐点移動反応にはRuvABタンパク質複合体が関与する。RuvAはHolliday構造に特異的に結合するタンパク質である。また、RuvAはRuvBと複合体を形成する。RuvBは六量体のリング構造を形成し、RuvAの両側からはさむように結合する。分岐点の移動はモータータンパク質であるRuvBのATP加水分解のエネルギーを利用して行われる。我々はRuvABタンパク質複合体によるHolliday構造DNAの分岐点移動を光学顕微鏡で直接検出することを試みた。RuvABによる分岐点移動が起こるときDNAの回転がおこる。そこで、この回転運動を検出することにした。まず、観察に必要な十字型構造のDNAを作製した。そしてその十字型構造DNAの一方をスライドガラス基板に固定し、もう片側に磁気ビーズを付け、磁石で引っ張りあげた。そこにRuvA、RuvBタンパク質を加え、RuvAB-Holliday構造複合体を形成させ、エネルギー源であるATPを加え、ビーズの動きを観察する。RuvBがHolliday構造DNAの上下方向に結合すると、DNAを上下方向に押し出すようにして、DNAは反時計方向にねじれ、反時計方向のビーズの回転が観察されることが予想される。左右方向にRuvBが結合した場合、ビーズの回転は時計回りになる。これまでに、何例かビーズの回転が観察された。今後、さらにこのビーズの回転を詳細に観察し、これまでの生化学的解析からでは測定が困難であった分岐点移動反応の速度や1分子のATPの加水分解にともなって移動するDNAの長さ等の測定を行い、RuvABタンパク質複合体よるHolliday構造DNAの分岐点移動反応のメカニズムを明らかにしたい。

Research Products

• [Publications] 上野太郎: "シャペロニン機能の1分子蛍光イメージング"センサ・マイクロマシーン準部門誌. 123(4). 107-111 (2003)
• [Publications] 船津高志: "単一分子計測とバイオフォトニクス"応用物理. 72(6). 727-730 (2003)
• [Publications] 多田隈尚史: "mRNA核外輸送の可視化"蛋白質核酸酵素. 48(4). 421-429 (2003)
• [Publications] 原田慶恵: "生物学実験法講座「1分子生理学」DNAモーターの1分子機能解析"日本生理学雑誌. 65(7・8). 225-231 (2003)
• [Publications] 原田慶恵: "RNAポリメラーゼによるDNAの回転をみる(イメージングで解き明かす生命機能 第3回)"実験医学. 21(13). 1800-1801 (2003)
• [Publications] 原田慶恵: "熱ゆらぎを利用して動く?-モータータンパク質の新しい運動モデル-"化学. 58(11). 48-49 (2003)
• [Publications] Zhang, G.: "The immobilization of DNA on microstructured patterns fabricated by maskless lithography."Sensors and Actuators B. 97. 243-248 (2004)
• [Publications] Harada, Y.: "Studies on Biomolecules Using Single Molecule Imaging and Manipulation Techniques."Science and Technology of Advanced Materials. (in press).
• [Publications] 原田慶恵: "「生体分子の1分子イメージング」生命科学への招待(太田博道・柳川弘志編著)"三共出版. 213 (2003)
• [Publications] 船津高志: "「タンパク質の相互作用と機能」ナノテクノロジーハンドブックIV編 バイオ・化学へ使う 5章4(ナノテクノロジーハンドブック編集員会編)"オーム社. 213 (2003)
• [Publications] 原田慶恵: "「DNAモーターを測る」ナノテクノロジーハンドブックIV編 バイオ・化学へ使う 6章3(ナノテクノロジーハンドブック編集員会編)"オーム社. 213 (2003)
• [Publications] 船津高志: "「バイオのナノ構造」ナノテクノロジー基礎シリーズ バイオナノテクノロジー 2章(堀池靖浩、片岡一則 編)"オーム社. 222 (2003)
• [Publications] 多田隈尚史: "「蛍光分子イメージングを用いたナノ分子の検出と機能解析」ナノバイオテクノロジーの最前線 6章4 ナノバイオテクノロジー"シーエムシー出版. 439 (2003)
• [Publications] Kanai, M.: ""PDMS microfluidics devices with PTFE passivated channels" Micro Total Analysis System 2003"Kluwer Academic Publishers (in press). (2003)
• [Publications] 上野太郎: "「1分子イメージングによるシャペロン研究」細胞における蛋白質の一生 蛋白質核酸酵素 増刊号(小椋光、遠藤斗志也、森正敬、吉田賢右編)"共立出版(印刷中). (2003)
• [Publications] 原田慶恵: "「DNA, RNAポリメラーゼ」生物物理学ハンドブック"朝倉書店(印刷中).
• [Publications] Funatsu, T.: "Rapid and Sensitive Detection Method of A Bacterium Using GFP Reporter Phage"Microbiol.Immuno.. 46. 365-369 (2002)
• [Publications] Fujiwara, I.: "Microscopic analysis of polymerization dynamics with individual actin filaments"Nature Cell Biol.. 4. 666-673 (2002)
• [Publications] 座古保: "生体機能を1分子レベルで探る-1分子蛍光イメージング-"分光研究. 51. 3-14 (2002)
• [Publications] 原田 慶恵: "1分子の動きを見て生体分子の機能を探る"光技術コンタクト. 40・12. 19-26 (2002)
• [Publications] Shirasaki, Y.: ""A Novel Biomolecule Sorter Using Thermosensitve Hydrogel in Micro Flow System" Micro Total Analysis System 2002"Kluwer Academic Publishers. 3 (2002)
• [Publications] 船津高志: "「1分子蛍光イメージング法」感覚器官と脳内情報処理"共立出版. 8 (2002)
• [Publications] 原田慶恵: "「DNA, RNAポリメラーゼ」生物物理学ハンドブック"朝倉書店(印刷中).
• [Publications] 原田慶恵: "「DNAモーターを測る」ナノテクノロジーハンドブック"オーム社(印刷中).
• [Publications] 原田 慶恵: "「生体分子の1分子イメージング」生命の科学と工学-その最先端"三共出版(印刷中).
• [Publications] 原田慶恵: "RNAポリメラーゼによるDNAの回転の可視化"細胞工学. 20. 636-637 (2001)
• [Publications] 原田慶恵: "RNAポリメラーゼはDNAを回転させて転写する"化学と生物. 39. 420-421 (2001)
• [Publications] Adachi,K.: "Stepping rotation of F1-ATPase visualized through angle-resolve single-fluorophore imaging."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 7243-7247 (2000)
• [Publications] Harada,Yoshie: "Direct observation of DNA rotation during transcription by Escherichia coli RNA polymerase"Nature. 409. 113-115 (2001)
• [Publications] Yasuharu Arai: "Tying a moecular knot with optical tweezers"Nature. 399. 446-448 (1999)
• [Publications] 原田 慶恵: "エバネッセント波を用いたDNA-RNAポリメラーゼ1分子相互作用のイメージング"精密工学会誌. 65. 205-208 (1999)
• [Publications] 原田 慶恵: "分子のひもを結ぶ"三田評論. 1015. 68-69 (1999)
• [Publications] 原田 慶恵: "DNA分子に結び目をつくる"遺伝. 53. 10-12 (1999)