cameleon1分子イメージングによる局所的カルシウム動態の解析

• Project/Area Number: 11242208
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 宮脇 敦史 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, チームリーダー (80251445)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 深野 天 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 ; 濱 裕 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (30261796) ; 水野 秀昭 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 専門職研究員 (80301779) ; 河野 弘幸 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (10332256) ; 筒井 秀和 独立行政法人理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 基礎科学特別研究員 ; 永井 健治 理化学研究所, 細胞機能探索技術開発チーム, 研究員 (20311350)
• Project Period (FY): 1999 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥86,300,000 (Direct Cost: ¥86,300,000); Fiscal Year 2003: ¥12,800,000 (Direct Cost: ¥12,800,000); Fiscal Year 2002: ¥12,800,000 (Direct Cost: ¥12,800,000); Fiscal Year 2001: ¥17,000,000 (Direct Cost: ¥17,000,000); Fiscal Year 2000: ¥21,200,000 (Direct Cost: ¥21,200,000); Fiscal Year 1999: ¥22,500,000 (Direct Cost: ¥22,500,000)
• Keywords: 蛍光タンパク質 / Digital Micromirror Device / ヒユサンゴ / シナプス形成 / インテグリン / グリア細胞 / プロテインキナーゼC / 発色団 / EGF / チロシンリン酸化 / 層流 / photoconversion / Kaede / GFP / YFP / cameleon / カルシウム / イメージング / 落射蛍光顕微鏡 / pericam / RFP / FRET / Ca^<2+>センサー / カルモデュリン / サファイア / 2光子励起 / エバネセント / 1分子イメージング / 蛍光エネルギー移動 / Green Fluorescent Protein / Red Fluorescent Protein

Research Abstract

当研究チームは2002年に、ヒユサンゴからクローニングした蛍光蛋白質カエデの、紫(外)光によって色が緑から赤に変換する特性を利用して、光で細胞をマーキングする技術を開発した。神経回路における神経細胞一個一個の全体像を浮かび上がらせたり、発生における細胞の系譜を追跡することに応用できることを証明した。さらに、緑と赤の状態のカエデたんぱく質の構造解析の結果、カエデたんぱく質の発色団が、その近傍のペプチド鎖切断に伴う構造変化によって緑色から赤色に変化するように広がることを解明した。そのペプチド鎖切断は、紫(外)光を吸収したカエデたんぱく質が触媒活性を発揮することによって実現するものと結論され、たんぱく質内で起こる光化学の新しい様相を発見することとなった。
・カエデ技術など光で操作する技術を、顕微鏡に盛り込む試みを行った。Digital Micromirror Device(PLUS社のプロジェクターから取り出した)を通常の顕微鏡の視野絞りに設置することによって、自由な証明パターンを可能にする光学システムを開発した。さらに縞投影法を組み合わせることによって、蛍光シグナルの断層像が容易に取得できる顕微鏡を作製した。
・神経細胞のシナプス形成がグリア細胞の存在によって促進されることは以前から知られている。「この効果がグリア細胞の接着因子あるいは液性因子、どちらによってもたらされるのか?」が問題にされてきた。これまで未開拓だった接着効果をはじめて体系的に証明した。神経細胞の局所に、インテグリンを介してグリア細胞が接着することで、プロテインキナーゼC系の活性化の伝播が起こり、神経細胞全体にわたってシナプス形成の顕著な亢進が起こることが証明された。

Research Products

• [Publications] Hama H., Hara C., Yamaguchi K., Miyawaki A.: "PKC Signaling Mediates Global Enhancement of Excitatory Synaptogenesis in Neurons Triggered by Local Contact with Astrocytes."Neuron. 41(3). 405-415 (2004)
• [Publications] Mizuno H, Mal TK, Tong KI, Ando R, Furuta T, Ikura M, Miyawaki A.: "Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein."Molecular Cell. 12(4). 1051-1058 (2003)
• [Publications] Miyawaki A., Sawano A., Kogure T.: "Lighting up cells : labelling proteins with fluorophores."Nature Cell Biology. 5. S1-S7 (2003)
• [Publications] Fukano T., Miyawaki A.: "Whole-field fluorescence microscope with digital micromirror device : imaging of biological samples."Applied Optics. 42(19). 4119-4124 (2003)
• [Publications] Karasawa S, Araki T, Yamamoto-Hino M, Miyawaki A.: "A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labeling."Journal of Biological Chemistry. 278(36). 34167-34171 (2003)
• [Publications] Miyawaki A: "Visualization of the Spatial and Temporal Dynamics of Intracellular Signaling."Developmental Cell. 4. 295-305 (2003)
• [Publications] Sawano A., Takayama S., Matsuda M., Miyawaki A.: "Lateral propagation of EGF signaling after local stimulation is dependent on receptor density"Developmental Cell. 3. 245-257 (2002)
• [Publications] Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Miyawaki A.: "An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein"Proceedings of the National Academy of Sciences. 99(20). 12651-12656 (2002)
• [Publications] Nagai T., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K., Miyawaki A: "A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications"Nature Biotechnology. 20. 87-90 (2002)
• [Publications] Sawano A., Hama H., Saito N., Miyawaki A.: "Multi-color imaging of Ca^<2+> and protein kinase C signals using novel epi-fluorescence microscopy"Biophysical Journal. 82. 1076-1085 (2002)
• [Publications] Miyawaki A., Mizuno H., Nagai T., Sawano A.: "Development of genetically-encoded fluorescent indicators for calcium"Methods in Enzymology. (2002)
• [Publications] Shimozono S., Fukano T., Nagai T., Kirino Y., Mizuno H., Miyawaki A.: "Confocal imaging of subcellular Ca^<2+> concentrations using a dual excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein"Science STKE. (2002)
• [Publications] Mochizuki N., Yamashita S., Kurokawa K., Ohba Y., Nagai T., Miyawaki A., Matsuda: "Spatio-temporal images of growth-factor-induced activation of Ras and Rap1"Nature. 411(6841). 1065-1068 (2001)
• [Publications] Kurokawa K., Mochizuki N., Ohba Y., Mizuno H., Miyawaki A., Matsuda M.: "A pair of FRET-based probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor protein in Vivo"J Biol Chem. 276(33). 31305-31310 (2001)
• [Publications] Matsushita F.,Miyawaki A.,and Mikoshiba K.: "Vomeroglandin/CRP-ductin is strongly expressed in the glands associated with the mouse vomeronasal organ : Identification and characterization of mouse vomeroglandin"Biochemical and Biophysical Research Communications. 268. 275-281 (2000)
• [Publications] Sawano A,and Miyawaki A.: "Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis"Nucleic Acids Research(アドレスhrrp://nar.oupjounals.org/cgi/reprint/28/16/e78.pdf). 28,No.16. e78 (2000)
• [Publications] Mizuno H.,Sawano A.,Eli P.,Hama H.and Miyawaki A.: "Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer"Biochemistry. 40(8). 2502-2510 (2001)
• [Publications] Nagai T.,Sawano A.,Park E.,and Miyawaki A.: "Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense to Ca^<2+>"Proceeding National Academy Science USA. 98(6). 3197-3203 (2001)
• [Publications] Miyawaki A., Tsien R. Y.: "Monitoring Protein Conformations and Interactions by Fluorescence Resonance Energy Transfer Between Mutants of Green Fluorescent Protein"Methods in Enzymology, Chimeric Proteins. (1999)
• [Publications] Miyawaki A., Llopis J., Mizuno H., Jelink K., Tsien R. Y.: "Cameleons as cytosolic and intra-organellar calcium probes"Oxford University Press, Calcium Signaling : A Practical Approach. (1999)
• [Publications] Mikoshiba K., Furuichi T., Miyawaki A., et al.: "Role of Inositol 1, 4, 5-Trisphosphate(IP_3) Receptor/Ca^<2+> Signaling in Cell Function"Japan Scientific Societies Press, Challenges for Neuroscience in the 21^<st> Century. (1999)
• [Publications] Matsushita F., Miyawaki A., Mikoshiba K.: "Vomeroglandin/CRP-ductin is strongly expressed in the gland associated with the mouse vomeronasal organ : identification and characterization of mouse vomeroglandin"Biochemical and Biophysical Research Communications. (2000)