| Budget Amount *help |
¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Fiscal Year 2000: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 1999: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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| Research Abstract |
トマトホモログ遺伝子の単離と発現解析
今年度はシロイヌナズナHSP27の相同クローンとして,トマト緑葉からLeMP26cDNAを単離し,その一次構造を明らかにし,さらに遺伝子発現パターンの解析を行った。単離したLeMP26cDNAから予想されるポリペプチドは238アミノ酸からなり,C末端側には低分子量熱ショックタンパク質に共通する保存配列(α-クリスタリンドメイン)が,N末端にはペルオキシソームへの輸送シグナルであるPTS2配列との相同配列が見い出された。また,25℃で育成したトマト緑葉に38℃の熱ショックを与え,熱ショック後のLeMP26mRNAの変動をRT-PCRで検討した。その結果,緑葉では既にmRNAの蓄積が観察されること,熱ショックによって急激にmRNA量が減少し,その後,時間の経過とともに発現量が回復することが明らかになった。これは,LeMP26が熱ショック応答遺伝子ではないことを示している。
組換えHSP27タンパク質を用いた機能解析
シロイヌナズナHSP27の組換えタンパク質を大腸菌で合成,精製し,in vitroにおける機能と分子構造の解析を試みた。しかし,成熟型HSP27タンパク質を大腸菌で合成することはできなかった。そこで,他の低分子量熱ショックタンパク質とのホモロジーが低いN末端側102アミノ酸を切除し,α-クリスタリンドメインを含むC末端側147アミノ酸のみからなる組換えタンパク質(ΔN-HSP27)を合成した。精製したΔN-HSP27の分子量をショ糖密度勾配遠心法によって推定したところ,約21kDであった。従ってΔN-HSP27は,溶液中ではモノマーとして存在すると考えられる。また精製標品のシャペロン活性を測定したが,タンパク質の熱変成を阻害する活性,変成タンパク質のrefoldingを促進する活性,いずれも検出されなかった。切除した領域の機能は全く不明であるので,今後は真核細胞発現系を使用して全長HSP27の合成を行い,改めて活性測定を行う予定である。
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