枯草菌sigma-H蛋白質複合体の細胞内動態の解明

Research Project

Project/Area Number	11760068
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	応用微生物学・応用生物化学
Research Institution	Saitama University (2000) Nara Institute of Science and Technology (1999)
Principal Investigator	朝井計埼玉大学, 理学部, 助手 (70283934)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	朝井計奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (70283934)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2000)
Budget Amount *help	¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000) Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 1999: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	枯草菌 / sigma-H / 複合体 / GFP
Research Abstract	1、sigma-H蛋白質の安定化に関与する巨大複合体を、複数回のショ糖密度勾配遠心法により精製し、さらにtriton-X、tween-20等の界面活性剤や尿素を用い、構成成分をある程度複合体から解離させる条件を検討中。構成成分の蛋白質レベルの解析のために、種々のエピトープタグ(T7、FLAG、HA、c-Myc、protein-C、6xHis等)に対する市販の抗体の使用を考えた。そのための、融合蛋白質作成用の組み込み型ベクターを構築し、各種の分泌・翻訳・転写に関与する因子にタグを融合させた株を造成し、複合体形成過程での挙動を観察中。 2、細菌は2種(PrfA、PrfB)の、終止コドン認識の異なる[それぞれ(UAA、UAG)、(UAA、UGA)]ペプチド鎖解離因子を持つ。申請者が新規に得たprfB変異株ではsigma-Hの半減期が野生株に比べ短く、このときsigma-H蛋白質は巨大複合体の状態のみ検出された。この変異株は50℃で増殖の温度感受性が見られる。共同研究において、終止コドンの認識効率(リードスルー)を測定したところ、prfB変異株では低温から高温まで、ほぼ一定の率でリードスルーを起こすことが判明し、従って胞子形成開始期はリードスルーに対し得に感受性が高いと考えられた(投稿準備中)。胞子形成開始期のsigma-H複合体形成において高頻度のリードスルーによる異常ペプチドの高生産の与える影響を解析中である。 3、GFP(green fluorescent protein)との融合蛋白質を用いて、枯草菌細胞内での蛋白質の局在性の観察をいくつかの機能未知な蛋白質に関して行った。その例を学術誌に報告した。近年見つけられた、DsRed(イソギンチャクの赤色蛍光蛋白質)もGFP同様に、枯草菌細胞中で局在性観察に用いることが可能で有ることがわかった。現在、Y(Yellow)-FP、C(Cyan)-FP等の変異型GFPとの融合用のベクターを開発中であり、GFPと併用し、同一細胞内での2重蛍光観察や、励起、放射波長の違いによるエネルギー転移を利用した細胞内での蛋白質の相互作用の検出などへの応用化を行っている。