| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2000: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 1999: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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| Research Abstract |
心室筋では,細胞内に高濃度のCa^<2+>を負荷すると強縮するため,NCX電流に対する細胞内Ca^<2+>濃度の影響の詳細な検討は難しい.継代培養可能で,かつ細胞内Ca^<2+>濃度を高くしても強縮しない細胞に,心筋型NCX遺伝子(NCX1)をトランスフェクトして安定発現株をクローン化し,簡便に心筋型NCX電流を測定できる系を確立するため以下の実験を行った.昨年度はNCX1のcDNAを作成,発現ベクター(pcDNA3)にサブクローニングし,各種細胞にリポフェクション法で発現した.何割かの細胞に発現していることはRT-PCRにより確認したが,発現した細胞を選別できなかった.
(1)NCX1を過剰発現した細胞の選別;NCX1が過剰発現した細胞は,細胞内にCa^<2+>を負荷してもNCX1が上昇した細胞内Ca^<2+>を排出するため細胞死を起こさないことが知られている.このことを利用してNCX1が過剰発現した細胞細胞のみを選別するために,細胞の培地中にCa^<2+>イオノフォアA-23187あるいはイオノマイシンを加えて培養を試みた.Ca^<2+>イオノフォアの濃度を検討したが選別できなかった.
(2)CD-8を発現させると金属のビーズを細胞のまわりにつけるために,可視的に発現細胞を見分けることができる.現在,CD-8とNCX1を共発現させる手法を検討中である.発現させるCD-8とNCX-1のcDNAの量とその比率時間などの検討を行なっている.共発現ができた後細胞に金属のビーズをまき,ビーズのついた細胞を指標にNCX1発現細胞と考え,NCX電流の測定を行う予定である.
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