過酸化水素によるp16発現誘導モデルを用いた細胞老化の研究

• Project/Area Number: 11770111
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Experimental pathology
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 小幡 雅彦 旭川医科大学, 医学部, 助手 (70301992)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2000: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 1999: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 細胞老化 / p16^<ink4a> / 過酸化水素 / マウス / 線維芽細胞 / p16^<INK4a>

Research Abstract

P16^<ink4a>は老化細胞で過剰発現が認められることより細胞老化との関与が示唆されている。しかし、その過剰発現が老化のトリガーとして作用するのか老化に伴う二次的変化であるのかは不明である。本研究では過酸化水素によりp16^<ink4a>発現を誘導せしめる系を用いて、その発現変化と老化形質の消退との関係を検討することによりその解明を試みた。
C57BL/6Jマウスより胎仔線維芽細胞を分離し、50-500μMの過酸化水素で24時間処理した後に細胞密度を希釈し継代した。そして処理細胞より系時的にtotal RNAを抽出しノーザンブロット法によりp16^<ink4a>発現を検討した。過酸化水素未処理細胞では発現は認められないが処理後より発現が誘導され5日後には高発現するに至った。過酸化水素濃度間では明らかな発現量差は認められなかった。この過酸化水素処理後5日目の細胞は大きく広がり扁平化し老化細胞様の形態を示すとともに、β-ガラクトシダーゼ染色に陽性所見を呈することから老化細胞としての形質を有していると考えられた。また処理5日目の老化様細胞は未処理細胞の40%前後の[^3H]-Thymidine取り込み率を示すことから、p16^<ink4a>発現により細胞増殖抑制が起こされたものと考えられる。過酸化水素濃度間で増殖抑制度に明らかな差異を認めなかった。以上から過酸化水素はp16^<ink4a>発現を誘導せしめることにより早期細胞老化を引き起こすことが示唆された。この過酸化水素誘導老化細胞を長期培養するとその中に増殖能を再獲得したと思われる細胞集団の出現が見られることから、過酸化水素誘導早期老化は可逆的現象である可能性がある。さらに細胞老化におけるkey moleculeとして知られるp53を中心とする遺伝子群の関与を検討した。p53,p21^<wafl>の発現変化をノーザンブロット法で検討したところ未処理細胞と老化様細胞間で発現量の変化は認められなかった。
以上より、過酸化水素誘導早期老化現象はp53非依存性にp16^<ink4a>により誘導される現象であると考えられる。