PCRランダム変異法による緑膿菌サイトトキシンの構造と機能に関する研究

• Project/Area Number: 11770136
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Bacteriology (including Mycology)
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 大西 真 信州大学, 医学部, 助手 (10233214)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000); Fiscal Year 2000: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 1999: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: 緑膿菌 / サイトトキシン / PCRランダム変異法 / 細胞毒素 / PCR変異法

Research Abstract

PCRランダム変異法により、緑膿菌サイトトキシンの細胞傷害活性が低下した44種類の1アミノ酸置換変異毒素を得ることができた。
変異毒素の定量化のために、毒素N末端領域に対応する9アミノ酸残基から成るペプチドを合成し、ペプチド抗体の作成を試みた。得られたペプチド抗体は、本毒素に対しての充分な感受性と特異性を持つことが明かとなった。7500倍希釈した抗ペプチド抗体を一次抗体として使用することにより精製野生型活性型毒素の12.5-100μg/mlをウエスタン法で定量化することが示された。
得られた変異毒素の性状解析を行うために部分精製を試みた。しかしながら、81%の変異毒素は不溶性画分に存在した。発現条件を検討したが現在のところ可溶化の条件は見いだされなかった。
一方、可溶性の変異毒素のなかでΔC20H201Rの比活性は野生型であるΔC20WTに比較して179倍以上低下していることが示された。ΔC20H201Rでは標的細胞膜結合能が著しく低下している可能性を示唆する知見を得た。このことは、201位近傍が毒素受容体への結合領域であることを示すものである。
今後の研究の展開として、本研究で得られたΔC20H201Rは未だ明らかにされていない緑膿菌サイトトキシン受容体の同定に利用できるものと考えられる。更に今回得た多数の変異毒素の可溶化を実現する条件を見いだすことが、緑膿菌サイトトキシンの構造と機能に関する研究の進歩に重要であることと考える。