| Budget Amount *help |
¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 1999: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Research Abstract |
補体依存な血清殺菌因子-RaRF-の多糖体結合成分であり,自然免疫に関わるヒト血清コレクチンであるマンノース結合レクチン(MBL)について,1.ヒト肝臓型MBL(MBL-A)cDNAのクローニング,2.遺伝子構造解析,3.蛋白解析を試み,以下の成果を報告する.
1.肝臓型MBL塩基配列の相同性によるPCRクローニング
(1)マウス,アカゲサルのMBL-AcDNAの塩基配列より,MBL蛋白ドメイン構造,ゲノム構造を考慮してPCRプライマーを設計し,ヒト肝臓cDNAからMBL-A候補cDNAを得た.
(2)候補遺伝子はアカゲサル肝臓型MBLcDNAとおよそ78%以上,ヒト血清型MBLとおよそ60%の塩基配列相同性を持ち,演繹されたアミノ酸配列から,ヒト肝臓型MBLはneckドメイン領域に存在する終止コドン変異によりコラーゲンドメインまでしか持たない蛋白として発現していることがわかった.
2.遺伝子構造解析
(1)候補cDNAの塩基配列を参考にゲノムPCRを行い,ヒト肝臓型MBLゲノム構造を解析した.
(2)候補遺伝子は他のMBLと同様N末端,コラーゲン,neck及びCRD4つのドメインから成るエクソンを構成しており,cDNAとの比較からスプライシングの違いにより2種類のmRNAから2種類の不完全蛋白が発現している可能性が示唆された.
3.蛋白解析
(1)蛋白解析に用いるリコンビナント蛋白を作製するために,バキュウロウイルスベクター系を用いて,RaRF構成蛋白の内,MASP1,MASP2,MBL(血清型,肝臓型)の各発現コンストラクトを作成し,発現ウイルスクローンを得た.
(2)同じく,RaRF構成蛋白に特異的な抗体を得るために,1リットルのヒト血清からRaRF複合体を精製し,これを免役して各種モノクローン抗体を得た.
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