| Project/Area Number |
11770153
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Virology
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
丸尾 聖爾 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助手 (70292018)
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| Project Period (FY) |
1999 – 2000
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2000)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2000: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 1999: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
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| Keywords | EBウイルス / EBER / Three hybrid システム / RNA結合蛋白質 / パーキットリンパ腫 / 結合蛋白 |
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| Research Abstract |
EBウイルスがコードする小RNA(EBER)は細胞にアポトーシス耐性を賦与することが明らかとなっているが、その詳細な機序は不明である。EBERの活性発現の機序を知るためにはEBER結合蛋白質の同定が必要と考えられるが、網羅的なスクリーニングは行われていない。そこで、three-hybridシステムを用い、EBER結合蛋白質のスクリーニングを行うこととした。
最初に、このシステムでEBERとEBER結合蛋白質の結合が検出可能か否かを確認するために、既知のEBER結合蛋白質とEBER1、2との結合を解析した。その結果、その内の一つであるPKRとEBER2との特異的な結合が示された。そこで、ライブラリーのスクリーニングに移った。スクリーニングは、EBウイルス感染不死化B細胞から調製したcDNAライブラリーをEBER2と共に酵母で発現させることにより行った。ライブラリー由来蛋白質とEBER2を共発現する936万の酵母クローンを、EBER2への結合の指標であるレポーター遺伝子の発現によりスクリーニングしたところ、3125の陽性クローンが得られた。さらに、これらを同様の別のレポーター遺伝子の発現によりスクリーニングしたところ、2913が陽性となった。次に、EBER2との結合に関係なくレポーターを発現させる疑陽性クローンを排除するために、EBER2非共存下ではレポーターを発現しないクローンをスクリーニングしたところ266クローンが残った。これらのクローンについて制限酵素消化パターンの解析および塩基配列決定によりインサートを解析したところ、既知のEBER結合蛋白質であるEAPが重複して含まれていることが分かり、スクリーニングは適切に行われていることが示唆された。現在はその他のクローンについて詳細な解析を進めている。
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