| Budget Amount *help |
¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 1999: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
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| Research Abstract |
免疫・炎症性細胞の中で,B細胞,骨髄球系細胞,マスト細胞に発現する新規膜表面受容体分子PIRのリガンド分子の同定を目的とした研究を,12年度研究計画に則り行った.その成果を以下2項にまとめる.
1.PIRのポリマータンパクの発現細胞の選定とタンパク精製
11年度の結果から,当初計画された293T細胞やCOS細胞を用いた一過性発現系では,PIRポリマーが細胞内に貯留し,分泌タンパクとしては回収・精製不能と判断された.12年度の研究では,ミエローマ細胞での安定発現系によるPIRポリマーの発現を実施し,分泌タンパクとして回収・精製されるかを検討した.その結果,一過性発現系の場合と同様に,PIRポリマーは細胞内に発現するものの分泌はされなかった.次に我々は,293T細胞を用いた一過性発現系に戻り,細胞分画よりPIRポリマーの精製を試みた,PIRポリマーcDNA構築を293Tに導入し,該タンパクの発現を確認後,細胞溶解液より抗FLAG抗体アガロースビーズで精製した.SDS-PAGE後の銀染色で,ほぼ単一バンドまでに精製されたPIRポリマーが得られたが,せいぜい10^8あたり1μg以下の回収率に止まった.
2.PIRポリマーを用いた細胞染色
1.で精製したPIRポリマーを用いて,マウス脾細胞の染色を行った.さらに,サイトカイン刺激後の脾細胞も同様の解析に供した.NK細胞マーカー,T細胞マーカーとPIRポリマーの組み合わせで,二重染色を施し,FACS解析装置によってPIRポリマーの結合を示す細胞種の同定を試みた.その結果,我々の精製したPIRポリマーに認識される細胞種は認められなかった.
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