rAVVを用いてのGH欠損症の筋肉および経口遺伝子治療の開発

• Project/Area Number: 11770430
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Pediatrics
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 野崎 和之 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (80312023)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2000: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
• Keywords: 遺伝子治療 / アデノ随伴ウイルス / 成長ホルモン / 下垂体性小人症

Research Abstract

平成12年度は成長モルモンを発現する組換えアデノ随伴ウイルスを作成した。米国ジエンザイム社よりすでに供与を受けているAAV作成システムを利用した。発現ベクターてあるpNTC3CMVにGHのcDNA組み込んだ。GH遺伝子はCMVプロモーターによりdriveされ、できあがったpNTC3CMV-GHとヘルパーブラスミドであるp5rep_CMVcapを293細胞(胎児腎臓由来細胞株)ヘカルシュウム・リン酸沈殿法によりトランスフェクションした。同時にtempreture sensitive mutantアデノウイルス(Ad5ts149)を感染した。これを39度で培養することによりAd5ts149は増殖せずrAAVのウイルスストックヘのアデノウイルスの混入を防げる。トランスフェクショシ48時間後に細胞と培養液を回収する。回収後、硫酸セルロース・アフィニティークロマトグラフィーにてrAAV-GHを濃縮した(平井幸彦ら、遺伝子治療の基礎技術、羊土社)。濃縮したrAAV-GHをまず培養皮膚線維芽細胞に感染させた。3-4日後に細胞上清中のGHをアマシャム社製のrat GH[^<125>I]アッセイシステムを用いて測定したところGHの発現を確認した。