三次元培養を用いた嚢胞腎責任遺伝子導入細胞の形態解析

• Project/Area Number: 11770607
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Kidney internal medicine
• Research Institution: Hokkaido University (2000); Tokyo Women's Medical University (1999)
• Principal Investigator: 望月 俊雄 北海道大学, 医学部・附属病院, 助手 (00277120)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2000: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 1999: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: 多発性嚢胞腎 / ADPKD / PKD1 / PKD2 / ポリシスチン / MDCK培養細胞 / 遺伝子導入

Research Abstract

常染色体優性遺伝性多発性嚢胞腎(ADPKD)は遺伝性腎疾患の中でも最も頻度の高い疾患で、その責任遺伝子としてPKD1遺伝子とPKD2遺伝子が同定されているが、その機能についてはまだ解明されていない。今回私たちは細胞レベルでPKD蛋白(ポリシスチン)がどのように振る舞い、そして尿細管細胞の形態形成においてどのような機能を有しているのかを検討する。昨年度は、尿細管細胞の一種であるLLCPK細胞およびMDCK細胞の培養系を確立し、発現ベクター(pCEP4およびpcDNA3.1)に組み込んだPKD2遺伝子の全長cDNAをリポゾーム法により遺伝子導入を行い、細胞から採取したRNAを用いてノザンブロット解析を行い、その発現を確認した。そこで今年度は、ヒトPKD2遺伝子に加えて、マウスpkd1遺伝子の全長cDNA(約13kb)をクローニングし、発現ベクター(pCI vector)に組み込むことに成功した。そこで、MDCK細胞をコラーゲンゲル内での3次元培養に行い、コントロールとして無添加の場合に嚢胞形成が起こること、またHGF(Hepatocyte growth factor)を添加することにより管腔形成されることを確認した。しかし、pkd1全長およびPKD2全長DNAや変異挿入発現ベクターについてのMDCK細胞への遺伝子導入については、コラーゲンゲル内での3次元培養を行ったが、いずれも嚢胞形成を認めており、無添加の場合と同じ結果であった。実際に遺伝子発現が認められるのかどうか確認する必要があり、今後の課題とした。