ニューロン・グリアにおける脳虚血ストレス応答の細胞内機構

• Project/Area Number: 11771418
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 上原 孝 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (00261321)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2000: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 1999: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: ニューロン / アポトーシス / 一酸化窒素 / ミトコンドリア / カスパーゼ / DNase / 脳虚血 / アストログリア / 低酸素ストレス / 分子シャペロン

Research Abstract

ヒト由来株化ニューロンモデル細胞SH-SY5Yに一酸化窒素(NO)を負荷すると,クロマチンの凝縮,DNA断片化,低DNA含量細胞や細胞膜上へのフォスファチジルセリンの露出を伴うアポトーシス様の死が起こることをこれまでに報告している.そこで,今年度はその詳細なアポトーシス実行過程を明らかにする目的で研究を行い,以下の知見を得た.
NOはミトコンドリアからのチトクロームcの漏出を惹起し,それに続いてカスパーゼ-2,-3,-6,-7,および-9の活性化を引き起こした.また,カスパーゼ-3の基質蛋白質であり,DNA断片化に関与するDNaseであるCADに結合して活性を制御しているinhibitor of CAD(ICAD)の分解もNOによって起こることが分かった.カスパーゼ-3阻害ペプチドを処理すると,カスパーゼ-2,および-7の切断が抑制されたことから,カスパーゼ-3はカスパーゼ-2および-7の上流で働いていることが示唆された.一方,NOは時間依存的にミトコンドリア内膜の膜電位を低下させることが明かとなった.内膜において,透過性を調節する複合体に作用するシクロスポリンAおよびbongkrekic acidはNOによるミトコンドリア膜電位の低下を有意に抑制し,さらにチトクロムCの細胞質への漏出とそれに続くDNAの断片化も抑制した.
以上のことから,NOはミトコンドリアに作用し,その膜電位を低下させることでアポトーシス実行因子であるチトクロムCを細胞質に放出させ,カスパーゼおよびDNaseを活性化して,アポトーシスを惹起している可能性が示唆された.

Research Products

• [Publications] Shinji Tanaka: "Up-regulation of protein-disulfide isomerase in response to hypoxia/brain ischemia and its protective effect against apoptotic cell death."Journal of Biological Chemistry. 275. 10388-10393 (2000)
• [Publications] Akihiro Ito: "Isolation of Ich-1S (caspase-2S) -binding protein that partially inhibits caspase activity."FEBS Letters. 470. 360-364 (2000)
• [Publications] Ryuichi Moriya: "Mechanism of nitric oxide-induced apoptosis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells."FEBS Letters. 484. 253-260 (2000)
• [Publications] Tadashi Nishiya: "Involvement of nuclear factor-κB (NF-κB) signaling in the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene in rat C6 glioma cells."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 275. 268-273 (2000)
• [Publications] Hiromichi Fujino: "Extracellular signal regulated protein kinase and c-Jun N-terminal kinase are involved in m1 muscarinic receptor-enhanced interleukin-2 production pathway in Jurkat cells."Biol.Pharm.Bull.. 23. 1198-1205 (2000)
• [Publications] Takashi Uehara: "Caspase activation accompanying cytochrome c release from mitochondria is possibly involved in nitric oxide-induced neuronal apoptosis in SH-SY5Y cells"Journal of Neurochemistry. 72. 196-205 (1999)
• [Publications] Takashi Uehara: "Pertussis toxin-sensitive and insensitive intracellular signaling pathways in undifferentiated 3T3-L1 cells stimulated by insulin converge with phosphatidylinositol 3-kinase at upstream of Ras-mitogen-activated protein (MAP), kinase cascade"European Journal of Biochemistry. 259. 801-808 (1999)
• [Publications] Hiroyuki Miyazaki: "1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-3,5-pyridinedicarboxylic acid methyl 6-(5-phenyl-3-pyrazolyloxy)hexyl ester (CV-159), on rat ischemic brain injury"Life Sciences. 64. 869-878 (1999)
• [Publications] Takashi Uehara: "Possible involvement of p38 MAP kinase in HSP70 expression induced by hypoxia in rat primary astrocytes"Brain Research. 823. 226-230 (1999)
• [Publications] Takashi Uehara: "Transient NF-κB activation stimulated by inteleukin-1β may be partly dependent on proteasome activity, but not phosphorylation and ubiquitination of IκBαmolecule, in C6 glioma cells"Journal of Biological Chemistry. 274. 15875-15882 (1999)
• [Publications] Akihiro Ito: "Possible involvement of cytochrome c release and subsequent activation of caspases in ceramide-induced apoptosis in SK-N-MC cells"Biochimica et Biophysica Acta. 1452. 263-274 (1999)