メチル水銀耐性に関わる因子の解明

• Project/Area Number: 11771482
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Environmental pharmacy
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 小出 のり 北里大学, 薬学部, 助手 (70296515)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2000: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1999: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: メチル水銀 / 耐性 / AMF法 / tyrosine hydroxylase

Research Abstract

平成11年度に引き続き、メチル水銀(MeHg)に対する耐性因子を検索するために、ラットpheochromocytoma(PC12)細胞より樹立したメチル水銀耐性細胞(PC12/TM)及び、その親株において発現量が異なっている遺伝子を解析した。まずPC12及びPC12/TM細胞間で発現量の異なる遺伝子をAMF(AFLP-based mRNA fingerprinting)法により検索した。AMF法は発現量の異なるmRNAをPCRを用いて検出する方法で従来のDifferential Display法よりも疑陽性の少ない方法である。このAMF法により検出した総数約14,000種類のfragmentのうち、PC12/TM細胞で発現量が高かったものは101種類、PC12細胞で高かった(即ち、PC12/TM細胞で発現が抑制されている)ものは128種類あった。PC12/TM細胞で発現量の高かった31種類についてノーザンブロット解析を行い確実にmRNAレベルが高い15種類の遺伝子断片を得た。これらの遺伝子の塩基配列を決定した結果、tyrosine hydroxylase、接着因子やケラチンなどの膜蛋白質及び未知の蛋白質をコードすることがわかった。これらの中から両細胞間の発現量の差が大きかったカテコールアミン合成の律速酵素であるtyrosine hydroxylase(TH)のcDNAをクローニングし、PC12細胞に強制発現させstable transformants(PC12-TH)を樹立した。PC12-TH細胞でのTH遺伝子の発現量をノーザンブロット解析により確認し、MTT aasay法によりMeHgに対する感受性を検討した。その結果、TH遺伝子の発現とMTT assay法による感受性には相関関係は認められなかった。
一方、PC12/TM細胞で発現が抑制されている遺伝子128種類のfragmentのうち32種類についても同様にノーザンブロット解析を行ったところ、確実にmRNAの発現が抑制されていた14種類の遺伝子断片が得られた。これらについては現在検討中である。MeHg耐性獲得には複数の因子が複雑に関与している可能性が考えられる。PC12細胞とPC12/TM細胞間で多くの遺伝子の発現量に顕著な差が認められることは、これらの遺伝子がMeHg耐性に関与する因子のcandidateになる可能性を示している。今後、これらの遺伝子のcDNAをクローニングし、複数の遺伝子を同時に強制発現させる等の方法を用いてMeHgに対する感受性に及ぼす影響を検討する必要がある。