哺乳類細胞のDNA複製開始機構の再構成:DNAポリメラーゼαを中心として

Research Project

Project/Area Number	11780457
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Functional biochemistry
Research Institution	The Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	水野武理化学研究所, 細胞生理学研究室, 研究員 (30281629)
Project Period (FY)	1999 – 2000
Project Status	Completed (Fiscal Year 2000)
Budget Amount *help	¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000) Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 1999: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	亜鉛フィンガードメイン / バキュロウイルス発現系 / α型ポリメラーゼ特異的阻害剤 / dehydroaltenusin / プライマーゼ / α型DNAポリメラーゼ / DNAポリメラーゼ / DNAポリメラーゼα / 酵母two-hybrid法 / DNA複製開始機構 / DNA複製 / 染色体複製機構
Research Abstract	マウスのDNAポリメラーゼαの触媒サブユニットであるp180のドメイン構造を明らかにするため、バキュロウイルス発現系による機能解析を試みた。p180の全長,110kDaのコアドメイン,31kDaのC末端亜鉛フィンガードメインを精製した。ポリメラーゼ活性を測定した結果、活性化DNAを鋳型とした比活性は全長とコアドメインとでほぼ一致し、コアドメインがポリメラーゼとしての必要十分な最小ドメインであることが確認された。一方、亜鉛フィンガードメインはp68と共発現させて始めて可溶性の複合体として精製され,一本鎖DNAに対して結合活性を有することを見出した。表面プラズモン共鳴実験の結果,亜鉛フィンガードメインが一本鎖DNAに対してコアドメインより付きにくいが離れにくいという性質を持つことが判明した。亜鉛フィンガードメインはα型ポリメラーゼに共通しており,他のポリメラーゼの亜鉛フィンガーモチーフの機能を比較することで,各ポリメラーゼの固有の特徴を浮き彫りにできるのではないかと考えられ,興味深い知見となった。一方,大量調製した精製コアドメインを用いてα型ポリメラーゼに特異的な阻害剤を検索したところ,dehydroaltenusinという物質がDNAポリメラーゼαに特異的な阻害効果を持つことを見出した。興味深いことに,この阻害効果は哺乳類細胞のDNAポリメラーゼαに特異的であり,魚類のDNAポリメラーゼα,ラットDNAポリメラーゼβ,ウシDNAポリメラーゼδ,ヒトDNAポリメラーゼε等に対しては阻害効果を示さなかった。また,aphidocolinよりも10倍以上も低い濃度のIC50を示した。阻害効果の機構を調べた結果,コアドメインの一本鎖DNA結合部位に配位し,template-primerとの結合を拮抗的に阻害することも明らかとなった。α型ポリメラーゼの核内での機能分担を解明する上で強力なtoolとなることが期待された。