スリーハイブリッドシステムによる生理活性物質の受容体遺伝子の探索

• Project/Area Number: 11876029
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Bioproduction chemistry/Bioorganic chemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 山口 五十麿 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (00012013)
• Project Period (FY): 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 1999: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
• Keywords: スリーハイブリッドシステム / アブシジン酸 / 植物ホルモン / ピリジルウレア

Research Abstract

本研究は,酵母における発現系を用いて低分子とタンパク質の相互作用を検出する系であるスリーハイブリッド系を用いて,植物の成長制御に関わる生理活性物質の受容体の遺伝子を探索する系を開発することを目的としている.植物のツーハイブリッド用のcDNAライブラリーとして充実しているGa14システムのライブラリーを利用することを計画し,宿主酵母にはYRG-2株を用いた.ラットのグルココルチコイド受容体のcDNA断片を増幅し,Ga14の結合ドメインと連結した融合遺伝子を持つベクターをYRG-2株に導入した.このホストにGa14の活性化ドメインと融合したシロイヌナズナのcDNAライブラリーを導入し,スクリーニングを行った.
ベイトにはアブシジン酸(ABA)を8-アミノカプリル酸ヒドラジドをスペーサーとしてデキサメサゾン誘導体に結合させたものおよび合成サイトカイニンであるピリジルウレアをジアミノアルカンをスペーサーにして,デキサメタゾン誘導体に結合させたものを用いた.
cDNAライブラリーを導入した酵母をベイトを含むヒスチジン無添加培地に散布し,培養した.ABAベイトを用いた培地では2個の陽性クローンが得られたが,スクリーニングを継続するうちにプラスミドが脱落し,以後のスクリーニングを継続できなくなった.スクリーニングの系の問題点を洗い出す作業を行っている.ピリジルウレアのベイトを用いる系では,まだ陽性クローンの検出には成功していない.