イオンチャネルの分子内構造変化と分子間相互作用の光学的新手法による解析の試み

• Project/Area Number: 11877010
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General physiology
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 久保 義弘 財団法人 東京都医学研究機構, 東京都神経科学総合研究所, 副参事研究員 (80211887)
• Project Period (FY): 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 1999: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
• Keywords: 内向き整流性K^+チャネル / 構造変化 / 光学的測定 / FRET

Research Abstract

分子内構造の変化を光学的に解析するためには、目的とする場所に特異的に蛍光ラベルを導入することが鍵となる。そこで、本研究においては、その第一歩として、この点についての検討を進めた。蛍光ラベルの導入法として、分子生物学的にGFP蛋白との融合蛋白を作る方法と、Cys残基に反応する化学合成された蛍光ラベルを用いる方法がある。クローン化された内向き整流性K+チャネルIRK1を対象として、まず、前者を試したところ、ポア領域等の厳密な構造が機能に要求される領域においては、GFPの「かさばり」が、機能の重篤な障害となることが明らかとなったので、この方法はポア領域の構造変化の研究には用いないことにした。後者の、点変異により導入したCys残基を利用した方法によりラベルを試みたところ、IRK1チャネルのCys149といったポアの外側入り口に、チャネル機能を障害することなく導入することができた。この際、発現系に内因的に存在する他の膜蛋白へのラベルの導入がバックグラウンドとして起きたが、IRK1チャネルをpCXN2高発現ベクターに組み入れHEK293T細胞に導入することにより、チャネルの発現密度を飛躍的に高めたところ、他の蛋白によるバックグラウンドと識別することができた。今後、チャネルの状態変化に伴う導入した蛍光強度の変化について定量的な解析を進め、さらに、2種の蛍光色素をラベルしてエネルギー転移の評価による構造変化の解析を行う。