アポトーシスの細胞内リアルタイムイメージング

Research Project

Project/Area Number	11877020
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	General medical chemistry
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	萩原正敏東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (10208423)
Project Period (FY)	1999
Project Status	Completed (Fiscal Year 1999)
Budget Amount *help	¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000) Fiscal Year 1999: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Keywords	apoptosis / caspase / PARP
Research Abstract	PARPのcaspaseによる切断部位をgreen fluorescent protein(GFP)とblue fluorescent protein(BFP)の間のpeptide linkerとして発現するよう組み込んだベクターを構築した。peptide linker内のcaspase切断部位であるDEVDG(in PARP wt)にアミノ酸のDA置換を行い(in PARP mut)、これをcaspase insensitiveなネガティブコントロールとした。さらに、linker内、核局在化シグナル(NLS:nuclear localization siganal)にアミノ酸置換を行い、発現タンパクが細胞内でそれぞれ核(NLS wt)、および細胞質(NLS mut)に局在するようにベクターを構築した。大腸菌タンパク発現用としてpETPARP wt NLS wt,pETPARP wt NLS mut,pETPARP mut NLS wt,pETPARP mut NLS mut,哺乳動物発現用としてpcDNA3PARP wt NLS wt,pcDNA3PARP wt NLS mut,pcDNA3PARP mut NLS wt,pcDNA3PARP mut NLS mutをそれぞれ構築した。前者による、pET systemを用いたリコンビナントタンパクの発現は、予想される分子量(約70KDa)を、CBB染色ならびに、抗GFP抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。同様に、哺乳動物細胞でも、Hela細胞、COS細胞、NIH3T3細胞に発現ベクターをトランスフェクション後、発現タンパクを抗GFP抗体でウエスタンブロッティング、さらに細胞染色により、その予想される分子量(約70KDa)ならびに細胞内局在を確認できた。