単一細胞RLCS法を用いた神経細胞虚血耐性関連遺伝子の探索

• Project/Area Number: 11877180
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Embryonic/Neonatal medicine
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 伏木 信次 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (80150572)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 矢追 毅 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (40311914) ; 福山 隆一 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (60199271)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2000: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 1999: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: 単一細胞 / RLCS法 / cDNA / 低酸素耐性 / 神経細胞 / 虚血 / 遺伝子 / ミトコンドリア

Research Abstract

単一細胞RLCS法を確立するに際しては、一方向性に合成された単一神経細胞由来全cDNAを、十分な検出感度を確保できる量にまで増幅するという問題を解決する必要がある.初年度は、ホモポリマー付加法やNelsonらによる方法での一方向性全cDNA増幅法を参考にcDNA調整法を検討・改良した結果、単一細胞由来一方向性cDNAライブラリー作成の基礎が作られた.実際、神経芽細胞株Neuro2aの単一細胞から全cDNAを、8割以上の成功率で増幅することができた。しかし、本法によるcDNA平均鎖長は1kb未満のため,RLCS法での解析には不向きであった。
次年度に、上述の方法をもとに更なる技術的検討を加えた結果、新たに確立した単一細胞RNA精製法やLong PCR用酵素・キメラオリゴヌクレオチド等の使用と組み合わせることにより,150bpから1.2kbに至る分布を示す単一細胞由来3'末端ビオチン化全cDNAを得ることに成功した.筋線維と単一シュワン細胞から本法によりcDNAを調整し、シュワン細胞からのみ特異的マーカー遺伝子cDNA断片等を増幅することにより特異性を確かめた。今回の改良により,通常得られるRLCSプロファイルの多くの領域をカバーできる単一細胞全cDNAが得られるものと期待された。今後、実際に個々のρ_0細胞からRLCSプロファイルを作成し、低酸素耐性関連遺伝子群のクローニングを試みたい。

Research Products

• [Publications] 伏木信次,田口泰子,木下周子,石川裕二,広部知久: "胎生期放射線照射による大脳皮質形成障害"放射線科学臨時増刊号放射線の生体影響とその修飾-実験発がんを中心として-(荻生俊昭,小木曽洋一編). 42. 162-168 (1999)
• [Publications] Yun I,Yaoi T,Watanabe S,Okajima S,Hirasawa Y,Fushiki S.: "Up-regulated uridine kinase gene identified by RLCS in the ventral horn after crush injury to rat sciatic nerves. "Biochem Biophys Res Commun. 266. 104-109 (1999)
• [Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,Hasegawa K,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Inhibiting neuronal migration by blocking NMDA receptors in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study. "Dev Brain Res. 114. 63-67 (1999)
• [Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,Hasegawa K,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Effects of ethanol on neuronal migration and neural cell adhesion molecules in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study. "Dev Brain Res. 118. 205-210 (1999)
• [Publications] Shimotake T,Inoue K,Tomiyama H,Iwai N,Fushiki S.: "Cell proliferation and apoptosis of enteric ganglia in neonates showing functional bowel obstruction. "Surgery in Childhood. 7. 65-68 (1999)
• [Publications] Matsushita H,Takeuchi Y,Kosaka K,Fushiki S,Kawata M,Sawada T.: "Changes in serotonergic neurons in the brain of pyrithiamine-induced acute thiamine-deficient mice. "Acta Neuropathol. 98. 614-621 (1999)
• [Publications] Kanemura Y,Hiraga S,Arita N,Ohnishi T,Izumoto S,Mori K,Matsumura H,Yamasaki M,Fushiki S,Yoshimine T.: "Isolation and expression analysis of a novel human homologue of the Drosophila glial cells missing (gcm) gene. "FEBS Letters. 442. 151-156 (1999)
• [Publications] Shiga K,Fushiki S.: "Proliferative capacity persists most tenaciously in the murine proximal rostral migratory stream. "Acta Histochem Cytochem. 33. 275-279 (2000)
• [Publications] Tsutsumi Y,Fushiki S.: "Comparison of cell kinetics between the boundary and the interboundary areas during hindbrain segmentation in the chick embryo. "Acta Histochem Cytochem. 33. 141-147 (2000)
• [Publications] 佐々木征行,橋本俊顕,島田司已,飯沼一宇,伏木信次,高野知行,岡〓次,近藤郁子,三池輝久.: "アンケートによる片側巨脳症全国調査."脳と発達. 32. 255-260 (2000)
• [Publications] Shiga K,Fukuyama R,Kimura S,Nakajima K,Fushiki S.: "Mutation of the sterol 27-hydroxylase gene(CYP27)results in truncation of mRNA expressed in leucocytes in a Japanese family with cerebrotendinous xanthomatosis"J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry. 67. 675-677 (1999)
• [Publications] Yuh I,Yaoi T,Watanabe S,Okajima S,Hirasawa Y,Fushiki S.: "Up-regulated uridine kinase gene identified by RLCS in the ventral horn after crush injury to rat sciatic nerves"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 266. 104-109 (1999)
• [Publications] Morimoto S,Sasaki S,Itoh H,Nakata T,Takeda K,Nakagawa M,……Fushiki S.: "Sympathetic activation and contribution of genetic fators in hypertension with neurovascular compression of the rostral ventrolateral medulla"J.Hypertens.. 17. 1577-1582 (1999)
• [Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,.,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Inhibiting neuronal migration by blocking NMDA receptors in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study"Dev.Brain Res.. 114. 63-67 (1999)
• [Publications] Hirai K,Yoshioka H,Kihara M,.,Sakamoto T,Sawada T,Fushiki S.: "Effects of ethanol on neuronal migration and neural cell adhesion molecules in the embryonic rat cerebral cortex : a tissue culture study"Dev.Brain Res.. 118. 205-210 (1999)
• [Publications] Kanemura Y,Hiraga S,Arita N,……,Fushiki S,Yoshimine T.: "Isolation and expression analysis of a novel human homologue of the Drosophila glial cells missing(gcm)gene"FEBS Letters. 442. 151-156 (1999)