C型肝炎ウイルスの増殖機構の解明

• Project/Area Number: 11877394
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 医薬分子機能学
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 土井 健史 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (00211409)
• Project Period (FY): 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1999: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / RNAポリメラーゼ / NS5b / コアタンパク質 / NS3 / 細胞内局在

Research Abstract

ウイルスタンパク質(コア、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b)の大腸菌における発現を試みた。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を、N末端にHis-tagが付加されるような発現ベクターに組み込み、発現を試みた結果、コアのC末端を除去した分子、NS3、NS4b、NS5b及びNS5bのC末端を除去した分子の発現がみられ、続いてこれらの分子をアフィニティカラムを用い精製した。NS2、NS4a、NS5aについては、効率の良い発現条件を現在検討している。これらのタンパク質を種々の組み合わせでNS5bに加え、NS5bの活性がどのように変化するかを調べ、ポリメラ-ゼ活性における補助因子を探求する予定である。
次に同じウイルスタンパク質について、それぞれの遺伝子を動物細胞内で発現できるベクターに組み込みCOS-7細胞内における発現を試みた。細胞内における発現を検出するため、NS5bはEGFPと、その他のタンパク質についてはHis-tagとの融合タンパク質として発現させる発現ベクターを構築した。それぞれのタンパク質のCOS-7細胞内での単独の発現を試み、タンパク質の発現と細胞内における局在を免疫組織学的染色法により確認した。さらに、NS5b発現ベクターと他のウイルスタンパク質発現ベクターを同時にCOS-7細胞に導入し、細胞を観察したところ、コアタンパク質、又はNS3タンパク質とNS5bを同時に発現させると、コアタンパク質、及びNS3タンパク質の細胞内局在が変化し、NS5bの局在と一致することが観察された。NS3はNS5bと協調して機能することが以前より示唆されていたが、コアタンパク質については全く新規な発見であった。さらにNS5bのC末端を欠如した分子とコアタンパク質を共発現させた場合、この効果は消失し、この欠如した領域にコアタンパク質と相互作用するドメインの存在が示唆された。現在、肝細胞系のHepG2細胞を用いて同様の発現、局在化を調べている。