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LC-MS/MSを用いたキナーゼ-基質ペア情報の網羅的探索とデータマイニング

Research Project

Project/Area Number 11J04786
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field ゲノム生物学
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

今村 春菜  京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2011 – 2013
Project Status Completed (Fiscal Year 2013)
Budget Amount *help
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2013: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2012: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2011: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Keywordsプロテオーム / リン酸化 / 質量分析 / タンパク質キナーゼ / シグナル伝達
Research Abstract

本研究ではタンパク質キナーゼと基質の関係性を明らかにすることを目的とし、in vitroキナーゼ法とLC-MS/MS解析を組み合わせた手法を試みた。昨年度は、本手法をc-AMP regulated protein kinase A (PKA)、extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1)、およびRAC-alpha serine/threonine protein kinase (AKTl)の三種のキナーゼに適用した。その結果、PKA、ERK1およびAKT1の基質リン酸化部位として、それぞれ3,585、4,374、および1,778種のリン酸化部位が同定された。
今年度は、昨年度に得られた大量のリン酸化部位から情報抽出を行い、各キナーゼが基質認識する際に重要となる要素を明らかにした(研究1)。その結果、得られたデータの情報量の豊富さゆえ、公共データベース登録のあった既知リン酸化部位情報と比べると、より詳細なモチーフ配列の検出が可能となった。大規模基質プロファイルから抽出したモチーフ配列は、既知リン酸化部位より同定されたモチーフ配列のみならず、キナーゼ特異的なモチーフを含む新規のモチーフ配列を多数含んでいた。また、同じキナーゼファミリーであるPKAとAKT1のモチーフ配列間での選択性評価から、既知基質情報の欠如が選択性の低いモチーフ配列の同定の原因となるという具体的な事例を示した。更に、モチーフ配列のみならず、リン酸基受容体(SまたはT)やリン酸基自身に対するキナーゼの選択性といった、その他の基質認識要素を示唆した。
続いて、PKAの阻害薬あるいは活性化薬にて刺激した細胞由来のタンパク質消化物に対してLC-MS/MS解析を行った研究2)。細胞内ではシグナル伝達が行われるため、これらの結果には、PKAの直接的また間接的なin vivo基質が共に含まれる。そこで、研究1で獲得したPKAのin vitro基質プロファイルを用いて、in vivo細胞内のPM直接基質の特定を試みた。その結果、本手法によって20以上のリン酸化部位がPKAの直接基質として同定された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

交付申請書に記載した研究実施計画に基づき、本年度は上述の研究1に関する結果をまとめた論文投稿中である。また、実験2の結果に関しては、現在投稿準備中である。

Strategy for Future Research Activity

(抄録なし)

Report

(3 results)
  • 2013 Annual Research Report
  • 2012 Annual Research Report
  • 2011 Annual Research Report
  • Research Products

    (10 results)

All 2013 2012 2011

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (9 results)

  • [Journal Article] Analytical strategies for shotgun phosphoproteomics : status and prospects2012

    • Author(s)
      Haruna Imamura, Masaki Wakabayashi, Yasushi Ishihama
    • Journal Title

      Seminars in Cell and Developmental Biology

      Volume: 23(8) Issue: 8 Pages: 836-42

    • DOI

      10.1016/j.semcdb.2012.05.007

    • Related Report
      2012 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Kinase-substrate network construction by LC-MS/MS coupled with in vitro kinase reaction2013

    • Author(s)
      Haruna Imamura, Naoyuki Sugi yama, Masaki Wakabayashi, Yasushi Ishihama
    • Organizer
      4th Asia Oceania Mass Spectrometry Confexence
    • Place of Presentation
      Taipei International Conve ntion Center(台湾)
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Phosphoproteomics approach coupled with in vitro kinase reaction to construct kinase-substrate network2013

    • Author(s)
      Haruna Imamura, Naoyuki Sugiyama, Masaki Wakabayashi, Yasushi Ishihama
    • Organizer
      HUPO 12th Annual World Congress
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜(神奈川県)
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Toward comprehensive analysis of kinase/substrate pairs by in vitro kinase assay coupled with phosphoproteome2012

    • Author(s)
      Haruna Imamura, Naoyuki Sugiyama, Masaki Wakabayashi, Minoru Nakano, Yasushi Ishihama
    • Organizer
      Keystone symposia Proteomics, Interactomes
    • Place of Presentation
      Stockholm (Sweden)
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] LC-MS/MSによるプロテインキナーゼの基質認識要素プロファイル2012

    • Author(s)
      今村春菜, 杉山直幸, 若林真樹, 石濱泰
    • Organizer
      日本ブロテオーム学会2012年大会
    • Place of Presentation
      日本科学未来館7階(東京)
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] A phosphoproteomic survey of protein kinase specificity with in vitro kinase assay2012

    • Author(s)
      Haruna Imamura. Masaki Wakabayashi, Naoyuki Sugiyama, Yasushi Ishihama
    • Organizer
      HUPO
    • Place of Presentation
      Boston (USA)
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] A systematic survey of protein kinase specificity by in vitro phosphoproteomic approaches2012

    • Author(s)
      Haruna Imamura, Naoyuki Sugiyama, Masaki Wakabayashi, Yasushi Ishihama
    • Organizer
      IMSC
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都)
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] プロテインキナーゼの基質認識に関わる要素の実験的および計算的ブロファイリング2012

    • Author(s)
      今村春菜、杉山直幸、若林真樹、石濱泰
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡)
    • Related Report
      2012 Annual Research Report
  • [Presentation] Development of proteome mining by in vitro kinase tagging2011

    • Author(s)
      今村春菜、高木俊輔、杉山直幸、若林真樹、中野実、石濱泰
    • Organizer
      第85回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府)
    • Year and Date
      2011-09-24
    • Related Report
      2011 Annual Research Report
  • [Presentation] リン酸化プロテオミクスを用いたタンパク質キナーゼの基質認識における特異性評価2011

    • Author(s)
      今村春菜、杉山直幸、若林真樹、中野実、石濱泰
    • Organizer
      日本プロテオーム学会2011年大会
    • Place of Presentation
      朱鷺メッセ新潟コンベンションセンター(新潟県)
    • Year and Date
      2011-07-29
    • Related Report
      2011 Annual Research Report

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Published: 2011-12-12   Modified: 2024-03-26  

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