ボツリヌス毒素の体内侵入に関わる小腸上皮細胞への結合機序の解明

• Project/Area Number: 11J10275
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Bacteriology (including Mycology)
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 犬井 健 東京農業大学, 生物産業学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2011 – 2012
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 2012: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2011: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
• Keywords: ボツリヌス毒素複合体 / 小腸上皮細胞 / 受容体 / 免疫沈降 / 糖認識 / 小角X線散乱 / 溶液構造 / 結晶化 / X線解析 / 糖結合部位

Research Abstract

食中毒の原因物質であるボツリヌス毒素は、汚染食品中で5種類のタンパク質成分(BoNT、NTNHA、HA-70、HA-33、HA-17)から構成される毒素複合体として存在する。経口摂取されたボツリヌス毒素複合体は、おもにHA-33の糖認識能により小腸上皮細胞表面の受容体糖鎖に結合し、体内へ侵入すると考えられているが、その結合機序は明らかにされていない。本年度は、小角X線散乱法(SAXS)を用い、3種類の単糖(N-アセチルノイラミン酸、ガラクトース、グルコース)非存在下および存在下におけるボツリヌスD型菌4947株由来HA-33/HA-17複合体の溶液構造を解析した。HA-33/HA-17複合体の結晶構造は、球状をした1分子のHA-17にダンベル状のHA-33が2分子結合し、V字型をしている。SAXS解析の結果、糖非存在下で、HA-33/HA-17複合体は"く"の字型をしており、HA-33/HA-17複合体の結晶構造を当てはめた結果、2分子のHA-33分子がHA-17を支点として折れ曲がっていると推測された。一方、糖存在下では、2分子のHA-33分子がHA-17を支点として左右に大きく開いた形、あるいはHA-33とHA-17が一直線状に伸びた形をしていると推測された。この様に、HA-33/HA-17複合体の溶液構造は糖の存在の有無によって明らかに異なった。このことから、ボツリヌス毒素複合体が小腸上皮細胞表面の糖鎖に結合する際に、HA-33/HA-17複合体の溶液構造が変化することが示唆された。さらに、NTNHAおよびHA-33を試料に用い、ラット小腸上皮細胞から抽出した膜タンパク質と混合後、免疫沈降を行い、受容体の可能性があるタンパク質のバンドをSDS-PAGE上で検出した。これらの研究実績は、ボツリヌス毒素の体内侵入に関わる小腸上皮細胞への結合機序の解明に寄与する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度、ボツリヌス毒素複合体の小腸上皮細胞への結合を促進する働きをもつHA-33/HA-17複合体の溶液構造が糖非存在下と糖存在下で異なることを明らかにした。このことにより、ボツリヌス毒素複合体が小腸上皮細胞表面の糖鎖に結合する際、HA-33/HA-17複合体の溶液構造が変化することが示唆された。このほか、免疫沈降法を種々の条件で行い、NTNHAおよびHA-33の受容体と考えられるタンパク質のバンドをSDS-PAGE上で検出した。これらの研究成果は、ボツリヌス毒素の体内侵入に関わる小腸上皮細胞への結合機序の解明に寄与する。

Strategy for Future Research Activity

小腸上皮細胞から受容体タンパク質の大量抽出を行い、N末端アミノ酸配列解析によってNTNHAおよびHA-33の受容体を特定する。また、糖鎖アレイ解析を行い、NTNHAおよびHA-33が認識する糖鎖構造を決定する。

Research Products

• [Journal Article] Random phage display based screening of peptides that bind to botulinum neurotoxin binding protein, nontoxic nonhemagglutinin. (2013)
  • Author(s): Sagane Y, Miyata K, Kurihara S, Yoneyama T, Inui K, Miyashita S, Hayashi S, Suzuki T, Niwa K,
  • Journal Title: Current Microbiology Volume: (Online) Issue: 2 Pages: 188-192
  • DOI: 10.1007/s00284-013-0355-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Small-angle X-ray scattering reveals structural dynamics of the botulinum neurotoxin associating protein, nontoxic nonhemagglutinin. (2012)
  • Author(s): Sagane Y, Miyashita S, Miyata K, Matsumoto T, Inui K, Hayashi S, Suzuki T, Hasegawa K, Yajima S, Yamano A, Niwa K, Watanabe T.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 425 Issue: 2 Pages: 256-260
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.07.077
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Purification and characterization of nontoxic protein complex from serotype D 4947 botulinum toxin complex. (2012)
  • Author(s): Miyata K, Sagane Y, Inui K, Miyashita S, Suzuki T, Oguma K, Ohyama T, Niwa K, Watanabe T.
  • Journal Title: Protein Journal Volume: 31 Issue: 5 Pages: 387-392
  • DOI: 10.1007/s10930-012-9413-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Toxic and nontoxic components of botulinum neurotoxin complex are evolved from a common ancestral zinc protein (2012)
  • Author(s): Inui, K., Sagane, Y., Miyata, K., Miyashita, S., Suzuki, T., Sikamori, Y., Ohyama, T., Niwa, K., Watanabe, T.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 419 Issue: 3 Pages: 500-504
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.02.045
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the Clostridium botulinum type D nontoxic nonhaemagglutinin (2012)
  • Author(s): Miyata, K., Inui, K., Miyashita, S., Sagane, Y., Hasegawa, K., Matsumoto, T., Yamano, A., Niwa, K., Watanabe, T., Ohyama, T.
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F Volume: 68 Issue: 2 Pages: 227-230
  • DOI: 10.1107/s174430911105603x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of sugar recognition by the toxin complex produced by Clostridium botulinum serotype C variant strain Yoichi (2011)
  • Author(s): Matsuo, T., Miyata, K., Inui, K., Ito, H., Horiuchi, R., Suzuki, T., Yoneyama, T., Oguma, K., Niwa, K., Watanabe, T., Ohyama, T.
  • Journal Title: FEMS Immunology Medicul Microbiology Volume: 63 Issue: 1 Pages: 35-43
  • DOI: 10.1111/j.1574-695x.2011.00825.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HA-33 facilitates transport of the serotype D botulinum toxin across a rat intestinal epithelial cell monolayer (2011)
  • Author(s): Ito, H., Sagane, Y., Miyata, K., Inui, K., Matsuo, T., Horiuchi, R., Ikeda, T., Suzuki, T., Hasegawa, K., Kouguchi, K., Oguma, K., Niwa, K., Ohyama, T., Watanabe T.
  • Journal Title: FEMS Immunology Medicul Microbiology Volume: 61 Issue: 3 Pages: 323-331
  • DOI: 10.1111/j.1574-695x.2011.00779.x
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ボツリヌス神経毒素結合タンパク質 非毒非血球凝集素の構造ダイナミクス (2013)
  • Author(s): 相根義昌、宮下慎一郎、犬井健、鈴木智典、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第86回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 幕張メッセ
  • Year and Date: 2013-03-18
• [Presentation] ボツリヌス神経毒素結合タンパク質 非毒非血球凝集素の小腸上皮細胞への結合および透過機構 (2013)
  • Author(s): 宮下慎一郎、相根義昌、犬井健、栗原小百合、鈴木智典、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第86回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 幕張メッセ
• [Presentation] ボツリヌス毒素の体内侵入に寄与するHA-33/HA-17複合体の構造ダイナミクス (2012)
  • Author(s): 犬井健、相根義昌、松本崇、宮下慎一郎、林慎太郎、川根武紘、栗原小百合、狩野聡史、鈴木智典、長谷川仁子、山野昭人、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本生化学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] ボツリヌス神経毒素結合タンパク質-非毒非血球凝集素の小腸上皮細胞層への結合および透過機構 (2012)
  • Author(s): 宮下慎一郎、相根義昌、犬井健、栗原小百合、狩野聡史、林慎太郎、川根武紘、鈴木智典、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本生化学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] ボツリヌス毒素複合体の形成機構は構成分子間の相互作用の強弱によって制御されるのか? (2012)
  • Author(s): 林慎太郎、相根義昌、犬井健、宮下慎一郎、狩野聡史、栗原小百合、川根武紘、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本生化学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] X線小角散乱により解明されたボツリヌス神経毒素結合タンパク質nontoxic nonhemagglutininの構造ダイナミクス (2012)
  • Author(s): 相根義昌、宮下慎一郎、松本崇、犬井健、林慎太郎、狩野聡史、栗原小百合、川根武紘、鈴木智典、長谷川仁子、山野昭人、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本生化学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] ボツリヌスD型菌1873株の産生する毒素複合体の糖認識特性 (2012)
  • Author(s): 川根武紘、相根義昌、宮田恵多、犬井健、宮下慎一郎、栗原小百合、林慎太郎、狩野聡史、鈴木智典、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本生化学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] D型ボツリヌス毒素の小腸上皮細胞層透過に関与する細胞内分子機構 (2012)
  • Author(s): 狩野聡史、相根義昌、宮下慎一郎、犬井健、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、渡部俊弘、丹羽光一
  • Organizer: 第85回日本生化学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] T7ファージディスプレイ法によるボツリヌス神経毒素複合体構成タンパク質、非毒非血球凝集素への結合ペプチドの同定 (2012)
  • Author(s): 栗原小百合、相根義昌、宮田恵多、米山徹、宮下慎一郎、犬井健、林慎太郎、狩野聡史、川根武紘、鈴木智典、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本生化学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場
  • Year and Date: 2012-12-15
• [Presentation] Structural dynamics of hemagglutinin complex in botulinum serotype D toxin complex. (2012)
  • Author(s): Inui K, Sagane Y, Matsumoto T, Miyashita S, Miyata K, Hayashi S, Kawane T, Kurihara S, Kano S, Suzuki T, Hasegawa K, Yamano A, Niwa K, Watanabe T
  • Organizer: Congress 22^<nd> IUBMB&37^<th> FEBS
  • Place of Presentation: Sevilla (Spain)
  • Year and Date: 2012-09-05
• [Presentation] Small-angle X-ray scattering revealed a structural dynamics of botulinum neurotoxin-associating protein, nontoxic nonhemagglutinin. (2012)
  • Author(s): Sagane Y, Miyata K, Matsumoto T, Inui K, Miyashita S, Hayashi S, Kano S, Kurihara S, Kawane T, Suzuki T, Hasegawa K, Yamano A, Niwa K, Watanabe T.
  • Organizer: Congress 22^<nd> IUBMB&37^<th> FEBS
  • Place of Presentation: Sevilla (Spain)
  • Year and Date: 2012-09-05
• [Presentation] Transport of the botulinum neurotoxin-associating protein, nontoxic nonhemagglutinin, across the intestinal epithelial cell layer. (2012)
  • Author(s): Miyashita S, Sagane Y, Miyata K, Inui K, Kurihara S, Kano S, Hayashi S, Kawane T, Suzuki T, Niwa K, Watanabe T.
  • Organizer: Congress 22^<nd> IUBMB&37^<th> FEBS
  • Place of Presentation: Sevilla (Spain)
  • Year and Date: 2012-09-05
• [Presentation] Clostridium botulinumの産生する神経毒素複合体の小腸上皮細胞結合に関与するHA-33/HA-17の溶液構造 (2012)
  • Author(s): 犬井健、相根義昌、松本崇、宮下慎一郎、林慎太郎、川根武紘、栗原小百合、狩野聡史、鈴木智典、長谷川仁子、山野昭人、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第79回日本細菌学会北海道支部学術総会
  • Place of Presentation: とかちプラザ
  • Year and Date: 2012-08-29
• [Presentation] Clostridium botulinumが産生する神経毒素結合タンパク質非毒非血球凝集素の結晶および溶液構造 (2012)
  • Author(s): 相根義昌、宮下慎一郎、松本崇、犬井健、林慎太郎、狩野聡史、栗原小百合、川根武紘、鈴木智典、長谷川仁子、山野昭人、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第79回日本細菌学会北海道支部学術総会
  • Place of Presentation: とかちプラザ
  • Year and Date: 2012-08-29
• [Presentation] ボツリヌス神経毒素結合タンパク質非毒非血球凝集素の小腸上皮細胞への結合および透過 (2012)
  • Author(s): 宮下慎一郎、相根義昌、宮田恵多、犬井健、栗原小百合、狩野聡史、林慎太郎、川根武紘、鈴木智典、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第79回日本細菌学会北海道支部学術総会
  • Place of Presentation: とかちプラザ
  • Year and Date: 2012-08-29
• [Presentation] ボツリヌスD型毒素複合体の溶液構造および各構成成分間の相互作用解析 (2012)
  • Author(s): 林慎太郎、相根義昌、松本崇、犬井健、宮下慎一郎、狩野聡史、栗原小百合、川根武紘、鈴木智典、長谷川仁子、山野昭人、丹羽光一、渡部俊弘
  • Organizer: 第79回日本細菌学会北海道支部学術総会
  • Place of Presentation: とかちプラザ
  • Year and Date: 2012-08-29
• [Presentation] 水晶発振子マイクロバランス法によるボツリヌスD型毒素複合体構成成分間相互作用の動力学的解析 (2012)
  • Author(s): 相根義昌、林慎太郎、宮田恵多、犬井健、宮下慎一郎、鈴木智典、丹羽光一、大山徹、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本細菌学会
  • Place of Presentation: 長崎ブリックホール
  • Year and Date: 2012-03-29
• [Presentation] ボツリヌス非毒非血球凝集素はメタロプロテアーゼか? (2012)
  • Author(s): 犬井健、相根義昌、宮田恵多、宮下慎一郎、鈴木智典、丹羽光一、大山徹、渡部俊弘
  • Organizer: 第85回日本細菌学会
  • Place of Presentation: 長崎新聞文化ホール
  • Year and Date: 2012-03-27
• [Presentation] ボツリヌス毒素複合体構成成分の非毒非血球凝集素の分子特性について (2011)
  • Author(s): 犬井健、宮田恵多、宮下慎一郎、長谷川仁子、松本崇、山野昭人、林慎太郎、丹羽光一、渡部俊弘、大山徹
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2011-09-24
• [Presentation] D型ボツリヌス毒素複合体の小腸上皮細胞層透過経路に関する研究 (2011)
  • Author(s): 吉田悠真、宮下慎一郎、狩野聡史、宮田恵多、犬井健、村松将司、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、渡部俊弘、大山徹、丹羽光一
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2011-09-24
• [Presentation] D型ボツリヌス毒素複合体が引き起こす小腸上皮バリアの機能傷害におけるMAPキナーゼの関与 (2011)
  • Author(s): 宮下慎一郎、吉田悠真、狩野聡史、宮田恵多、犬井健、村松将司、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、渡部俊弘、大山徹、丹羽光一
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2011-09-23
• [Presentation] ボツリヌスD型菌1873株の産生する毒素複合体構成成分HA-33の変異による毒素複合体の糖認識の改変 (2011)
  • Author(s): 宮田恵多、犬井健、宮下慎一郎、村松将司、吉田悠真、狩野聡史、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、渡部俊弘、大山徹、丹羽光一
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2011-09-22
• [Presentation] ボツリヌスC型菌変異株C-Yoichiの産生する毒素複合体の糖認識特性 (2011)
  • Author(s): 松尾智仁、林慎太郎、宮田恵多、犬井健、伊藤博章、堀内亮太、鈴木智典、米山徹、小熊恵二、丹羽光一、渡部俊弘、大山徹
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2011-09-22
• [Presentation] ボツリヌス毒素複合体形成におけるボツリヌス神経毒素および非毒非血球凝集素間の相互作用の解析 (2011)
  • Author(s): 村松将司、宮田恵多、犬井健、宮下慎一郎、吉田悠真、狩野聡史、川根武紘、栗原小百合、林慎太郎、丹羽光一、渡部俊弘、大山徹
  • Organizer: 第84回日本生化学会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2011-09-22
• [Presentation] THE ROLE OF NONTOXIC-NONHEMAGGLUTININ COMPONENT OF TOXIN COMPLEX PRODUCED BY CLOSTRIDIUM BOTULINUM (2011)
  • Author(s): Keita Miyata, Ken Inui, Masashi Muramatsu, Shin-Ichiro Miyashita, Yuhma Yoshida, Tomonori Suzuki, Keiji Oguma, Koichi Niwa, Toshihiro Watanabe, Tohru Ohyama
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies 2011 Congress
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2011-09-07
• [Presentation] Structure determination of toxin complex from Clostridium botulinum serotype D (2011)
  • Author(s): Kimiko Hasegawa, Takashi Matsumoto, Akihito Yamano, Keita Miyata, Ken Inui, Koichi Niwa, Toshihiro Watanabe, Tohru Ohyama
  • Organizer: XXII Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography
  • Place of Presentation: Madrid (Spain)