糖鎖-オリゴDNA複合体を用いたアンチセンスオリゴDNAの細胞ターゲッティング

• Project/Area Number: 12019225
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 鈴木 徹 岐阜大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (20235972)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 布藤 聡 日本製粉, 中央研究所, 主任研究員 ; 石田 秀治 岐阜大学, 農学部, 助教授 (20203002)
• Project Period (FY): 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 2000: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: アンチセンス / PNA / GFP / CAT / 無細胞タンパク質合成系 / 細胞ターゲッティシグ

Research Abstract

昨年度までの研究で我々は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を、in vitro転写翻訳系を用いて効率よく評価する方法を開発した。今回は、この系を用いて、PNAとオリゴDNAの効果を客観的に評価する事を試みた。まず、in vitro転写翻訳系における、配列に依存しない非特異的影響を調べるために、12merのランダム配列を有するPNAとs-オリゴを合成し、in vitro CAT発現に対する影響を見た。その結果、S-オリゴが200nMで約50%、600nMで80%の阻害を示したのに対し、PNAは、1μM以下の濃度では、全く影響を示さなかった。これは、S-オリゴのバックボーンが、生理的pHにおいて負の電荷を有するのに対し、PNAは電荷を有しないために、電荷を有しないためであると推察された。
次に、S-オリゴとPNAの効果を、最もPNAの効果が顕著であった翻訳開始点の配列(65)に関して検討した結果、で50%の阻害活性を示すために、PNAは30nM加えれば良かったのに対し、S-オリゴが900nMを必要とした。30倍強く転写を阻害する事が明らかになった。このことからもPNAが、S-オリゴに対し、より特異性の高いアンチセンス効果を示すことが明らかになった。
PNAのタンパク質合成の阻害効果が、確かに塩基配列に依存したアンチセンス効果によるものであることを明らかにするため、塩基配列を置換したPNAを用いて阻害効果を見た。P65cに見られるように、1塩基の違いによってPNAの効果は1/3倍ほど高い濃度が必要出会った。また、最大活性もWildが、90%程度の阻害を見せたのに対し、65%程度に留まった。4塩基置換を行ったものに関しては全く阻害を示さなかった。以上の結果から、PNAによる阻害効果が、確かに配列特異的なアンチセンス効果による物であることが確認された。