| Project/Area Number |
12024222
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
荒木 喜美 熊本大学, 発生医学研究センター, 助手 (90211705)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹田 直樹 熊本大学, 動物資源開発研究センター, 助手 (90304998)
荒木 正健 熊本大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (80271609)
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| Project Period (FY) |
2000
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2000)
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| Budget Amount *help |
¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2000: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
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| Keywords | Crel loxシステム / 挿入変異マウス / 胚性幹細胞 / 遺伝子トラップ |
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| Research Abstract |
我々は,単なる遺伝子破壊型の変異を作り出すだけではなく,トラップベクターのレポーター遺伝子を任意の遺伝子に置換できるようにするため,バクテリオファージP1由来のCre-loxシステムを応用し,組換え部位であるlox配列に変異を加えたものを用いることでES細胞でNDAを部位特異的に挿入させる方法を開発した。このCre-変異lox組換えシステムでは、lox配列の5'端3'端にそれぞれ変異を加えたlox71とlox66配列、中央部スペーサー領域に変異を加えたlox2272配列を組み合わせて用いる。このシステムをトラップベクターに用いることで、トラップされた遺伝子のプロモーターのコントロール下に別の遺伝子を発現させ、それをマウスで解析することができる。これら変異lox配列を用いた可変型遺伝子トラップベクターpU-17(intron-lox71-splice acceptor-beta geo-loxP-pA-lox2272-pSP73-lox511)を構築し、TT2ES細胞にエレクトロポレーションにより導入、トラップクローンの単離を行なった。現在までに合計767クローンを単離した。これらのクローンについて、挿入パターンをPCRおよびサザンブロットにより解析した結果、約半数のクローンが1コピーの挿入でlox配列を保持していることがわかった。それらのクローンを用い、順次キメラマウスの作製し変異マウスの系統樹立も行なっている。キメラマウスは実体顕微鏡下で行なえるモルラ胚とのアグリゲーション法で作製しており、現在までに34系統の変異マウスラインを樹立した。また、トラップされた遺伝子の解析も5'RACE法により進めている。まだ解析数は10クローン程度であるが、その手法は確立し、確実にRACE産物が得られるようになった。
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