| Project/Area Number |
12037213
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
関根 政実 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (70226653)
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| Project Period (FY) |
2000
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2000)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2000: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
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| Keywords | 細胞周期 / サイクリンD / Rb / 細胞内局在性 / タンパク質安定性 / 誘導発現系 |
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| Research Abstract |
(1)タバコサイクリンD遺伝子のプロモーター領域にGUS(β-glucuronidase)を連結してタバコ植物で形質転換体を作出した結果、GUSの組織染色により根端や側根の分裂組織で発現が見られ、プロモーター領域に分裂組織での発現に必要なシス因子が含まれることが示された。(2)タバコサイクリンDにGFP(green fluorescent protein)を融合させて、CaMV35Sプロモーター制御下で形質転換BY-2細胞を作出し、細胞内局在性を解析した。野生型との融合GFPは主に核に局在したが、191番目のスレオニンをアラニンに置換した変異体(T191A)では主に細胞質に局在した。次に、グルココルチコイド誘導発現系を構築し、dexamethasone処理により誘導発現させて洗浄後のタンパク質の安定性を解析した結果、296および300番目のセリンをアラニンに置換した変異体(S296,300A)では野生型より安定だが、T191Aでは野生型よりも安定性が低下していた。またS296,300Aの誘導発現により細胞の増殖速度が顕著に速くなることが分かった。(3)グルココルチコイド誘導発現系によりタバコRbのすべてのリン酸化部位をアラニンに置換した変異体を形質転換したBY-2細胞を作出した結果、dexamethasone処理によるタバコRbの誘導発現によって細胞の増殖が遅くなった。また、タバコRbに対する特異抗体を精製してWestern解析した結果、BY-2細胞の増殖期では約113kDaにバンドが検出されたが増殖停止期では検出されなかった。mRNAは常にほぼ同程度存在することから、タバコRbタンパク質は転写後に発現制御されることが示唆された。(4)BY-2細胞を用いた一過性の発現解析により、量依存的なタバコRbによるE2Fの転写活性化の抑制を支持する結果が得られた。
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