複製フォーク複合体の形成とその制御機構の研究

• Project/Area Number: 12141203
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyushu University (2003-2004); Nara Institute of Science and Technology (2000-2002)
• Principal Investigator: 釣本 敏樹 九州大学, 大学院・理学研究院, 教授 (30163885)
• Project Period (FY): 2000 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥50,400,000 (Direct Cost: ¥50,400,000); Fiscal Year 2004: ¥11,300,000 (Direct Cost: ¥11,300,000); Fiscal Year 2003: ¥11,100,000 (Direct Cost: ¥11,100,000); Fiscal Year 2002: ¥10,200,000 (Direct Cost: ¥10,200,000); Fiscal Year 2001: ¥17,800,000 (Direct Cost: ¥17,800,000)
• Keywords: WRNヘリカーゼ結合因子 / DNAポリメラーゼδ / 染色体接着 / クランプローダー / クランプ / ATPase / ユビキチン / DNAポリメラーゼ / チェックポイント / PCNA結合蛋白質 / 質量分析 / 電子顕微鏡 / DNAのメチル化 / 再構築 / PCNA / DNAメチル化酵素 / CDK / サイクリン / p21

Research Abstract

1.WRNヘリカーゼ結合因子(WRNIP1)による複製フォーク進行制御
ヒトWRNIP1はWRNヘリカーゼに結合するだけでなく、ヒトDNAポリメラーゼδと特異的に相互作用する。この因子の複製活性制御に係わる機能を明らかにするため、ヒトWRNIP1の発現系を構築し精製した。その結果、8量体複合体として振る舞い、DNAにより促進されるATPase活性を有した。またDNAポリメラーゼδの合成開始効率を上昇させることを明らかにした。さらに、この活性促進がATPase活性によって負に調節を受けることから、複製フォーク進行時に、DNA損傷を感知しながらDNA合成活性の制御を行っていることが示唆された。
2.複製フォーク進行と染色体接着の連係機構の解析
染色体接着に関与するChl12-RFC複合体が複製クランプPCNAの第2のローダーとして機能することを明らかにした。このことはPCNAクランプを介して複製フォークの進行と染色体接着反応が連係していることを意味する。さらに細胞の粗抽出液を使った反応系ではChl12-RFCによるPCNAローディングが見られないことから、細胞内ではPCNAローダーを使い分ける機構があることが考えられた。そこで、細胞抽出液を分画し、その特異性因子を検索し、Chl12-RFCによるPCNAローディングを抑制する因子と共に、Chl12-RFCによって特異的に促進を受けるDNAポリメラーゼ活性を見出した。
3.ユビキチン化PCNAの精製と機能解析
PCNAのユビキチン化がどのように複製フォーク進行制御に係わっているかを明らかにするため、最低1個のサブユニットが必ずユビキチン化されたPCNAを作成し、その機能変化を解析した。その結果、DNAローディング活性は影響を受けなかったが、PCNAの標的となるDNAポリメラーゼの中に活性が抑えられるものがあることが示された。

Research Products

• [Journal Article] Human Werner helicase interacting protein 1 (WRNIP1) functions as a novel modulator for DNA polymerase δ. (2005)
  • Author(s): T.Tsurimoto
  • Journal Title: Genes to Cells 10 Pages: 13-22
• [Journal Article] Rad18 guides poleta to replication stalling sites through physical interaction and PCNA monoubiquitination (2004)
  • Author(s): K.Watanabe
  • Journal Title: EMBO J. 23 Pages: 3886-3896
• [Journal Article] The reconstituted human Chl12-RFC complex functions as a second PCNA loader. (2004)
  • Author(s): Y.Shiomi
  • Journal Title: Genes to Cells 9 Pages: 279-290
• [Book] 複製フォーク複合体(細胞周期イラストマップ)(中山敬一編) (2005)
  • Author(s): 釣本 敏樹
  • Total Pages: 7
  • Publisher: 羊土社
• [Publications] Tatsumi, Y.et al.: "The ORC1 cycle in human cells : I. Cell cycle-regulated oscillation of human ORC1."J.Biol.Chem.. 278. 41528-41534 (2003)
• [Publications] Ohta, S.et al.: "The ORC1 cycle in human cells : II. Dynamic changes in the human ORC complex during the cell cycle."J.Biol.Chem.. 278. 41535-41540 (2003)
• [Publications] Shiomi, Y.et al.: "The reconstituted human Chl12-RFC complex functions as a second PCNA loader"Genes Cells. 9(In press). (2004)
• [Publications] 釣本 敏樹: "化学フロンティア:ポストゲノムの分子生物学(村上康文編) ゲノム複製メカニズムの理解を目指して"化学同人. 12 (2003)
• [Publications] S.Ohta: "A proteomics approach to identify PCNA binding proteins in human cell lysates : identification of the human CHL12/RFCs2-5 complex as a novel PCNA binding protein"J. Biol. Chem.. 277. 40362-40367 (2002)
• [Publications] T.Iida: "PCNA clamp facilitates action of DNA cytosine methyltransferase 1 on hemimetylated DNA"Genes Cells. 7. 997-1007 (2002)
• [Publications] Y.Shiomi: "Clamp and clamp loader structures of human checkpoint protein complexes, Rad9-1-1 and Rad17-RFC"Genes Cells. 7. 861-868 (2002)
• [Publications] R.Tadokoro: "Scheduled Conversion of Replication Complex Architecture at Replication Origins of S.cerevisiae during the cell cycle"J. Biol. Chem.. 277. 15881-15889 (2002)
• [Publications] 釣本敏樹: "松影昭夫・正井久雄編、「ゲノムの複製とその制御」シュプリンガー・フェアーラーク東京"クランプとクランプローダー. 10 (2002)
• [Publications] Tadokoro, R. et al.: "Scheduled Conversion of Replication Complex Architecture at Replication Origins of S. cerevisiae during the cell cycle"J Biol Chem.. (In press). (2002)
• [Publications] Ishino, Y. et al.: "Functional interaction of an archaeal sliding clamp with mammalian clamp loader and DNA polymerase δ"Genes Cells. 6. 699-706 (2001)
• [Publications] Ohki, R. et al.: "In vitro reconstitution of the end replication problem"Mol Cel. Biol.. 21. 5753-5766 (2001)
• [Publications] Shikata, K. et al.: "The human homologue of fission yeast cdc27, p66, is a component of active human DNA polymerase δ"J. Biochem.. 129. 699-708 (2001)
• [Publications] 釣本敏樹: "生化学誌特集「DNAポリメラーゼ」:DNAポリメラーゼδ"日本生化学会(In press). (2002)
• [Publications] Shiomi,Y.: "ATP-dependent structural change of the eukaryotic clamp loader protein, RFC."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 14127-14132 (2000)
• [Publications] Hohmura,K.: "AFM with carbon nanotube probe resolves the subunit organization of protein complexes."J Electron.Microsc.. 49. 415-421 (2000)
• [Publications] Tatsumi Y,: "Association of human origin recognition complex 1 with chromatin DNA and nuclease-resistant nuclear structures."J Biol Chem.. 275. 5904-5910 (2000)
• [Publications] Shikata,K.: "The Human Homologue of Fission Yeast cdc27, p66, Is a Component of Active Human DNA Polymerase δ."J.Biochem.. In press. (2001)
• [Publications] Tsurimoto,T.: "Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions-Applications of BIACORE (ed.K.Nagata and H.Handa)"DNA polymerase δcomplex.. 10 (2001)