受精機構におけるユビキチン-プロテアソームシステム

• Project/Area Number: 12146201
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 横沢 英良 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (90012765)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川原 裕之 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (70291151) ; 山尾 文明 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 教授 (10158074) ; 澤田 均 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (60158946)
• Project Period (FY): 2000 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥49,500,000 (Direct Cost: ¥49,500,000); Fiscal Year 2004: ¥12,400,000 (Direct Cost: ¥12,400,000); Fiscal Year 2003: ¥12,500,000 (Direct Cost: ¥12,500,000); Fiscal Year 2002: ¥12,300,000 (Direct Cost: ¥12,300,000); Fiscal Year 2001: ¥12,300,000 (Direct Cost: ¥12,300,000)
• Keywords: ユビキチン / プロテアソーム / 受精 / 卵黄膜 / 発生 / ユビキチンレセプター

Research Abstract

1.マボヤ卵黄膜蛋白質VC70のユビキチンリガーゼの探索:すでに、マボヤ精子放出液からVC70蛋白質をユビキチン化する分子量700kDaのユビキチン化酵素を単離し、さらに、そのユビキチン化活性を促進するユビキチンリガーゼE3様酵素を、ユビキチン化サイトLys234を含むVC70ペプチドを固定化したカラムを用いたクロマトグラフィーにより単離した。しかし、得られた蛋白質量が微量のために生化学的解析が不可能であったので、上記のVC70ペプチドをベイトに用いて酵母two-hybridスクリーニングを行い、2つのVC70ペプチド結合蛋白質を得た。一つは、UBAドメイン含有蛋白質で、これはVC70蛋白質が酵母内でユビキチン化され、そのポリユビキチン鎖を介して結合蛋白質として得られたと考えられる。一方、マボヤの近縁種であるカタユウレイボヤのESTデータベース検索の結果、もうひとつのクローンは全長ではなく、N末端配列を欠失したものであると推測される。この全長をクローニングし、VC70蛋白質のE3酵素である可能性や受精における役割を明らかにすることが今後の課題である。2.胚特異的ユビキチンレセプターの機能解析:アフリカツメガエルの胚特異的ユビキチンレセプターRpn10cが抗アポトーシス因子Scytheと特異的に結合する。Rpn10cとの結合に関与するScytheのN末端領域を解析し、それがタンデムに連結した4つのユビキチン様ドメインからなり、少なくとも2つのドメインの存在がRpn10cとの結合に必要であることを明らかにした。また、そのドメインがアポトーシス制御に必要であることを明らかにした。Rpn10cを含む胚特異的プロテアソームがScytheを介してどのように発生過程におけるアポトーシスを制御しているかを明らかにすることが今後の課題である。

Research Products

• [Journal Article] Himeic acid : A new ubiquitin-activating enzyme inhibitor isolated from a marine-derived fungus, Aspergillus sp. (2005)
  • Author(s): Sachiko Tsukamoto
  • Journal Title: Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 15 Pages: 191-194
• [Journal Article] Self/nonself recognition in ascidian fertilization : Vitelline coat protein HrVC70 is a candidate allorecognition molecule (2004)
  • Author(s): Hitoshi Sawada
  • Journal Title: Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America 101・44 Pages: 15615-15620
• [Journal Article] Semlp is a novel subunit of the 26S proteasome from Saccharomyces cerevisiae (2004)
  • Author(s): Takayuki Sone
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 279・27 Pages: 28807-28816
• [Journal Article] Rpn7 is required for the structural integrity of the 26S proteasome of Saccharomyces cerevisiae (2004)
  • Author(s): Erika Isono
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 279・26 Pages: 27168-27176
• [Journal Article] ユビキチンシステムのメカニズム (2004)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Journal Title: 医学のあゆみ 211・1 Pages: 5-11
• [Publications] Naoyuki Sakai: "Extracellular ubiquitin system implicated in fertilization of the ascidian, Halocynthia roretzi : Isolation and characterization."Developmental Biology. 264・1. 299-307 (2003)
• [Publications] Eri Sakata: "Parkin binds the Rpn10 subunit of 26S proteasomes through its ubiquitin-like domain."EMBO Reports. 4・3. 301-306 (2003)
• [Publications] Yayoi Kimura: "N-Terminal modifications of the 19S regulatory particle subunits of the yeast proteasome."Archives of Biochemistry and Biophysics. 409・2. 341-348 (2003)
• [Publications] Narudo Kawai: "Regulation of ascidian Rel by its alternative splice variant."European Journal of Biochemistry. 270・22. 4459-4468 (2003)
• [Publications] Megumi Yamakami: "Tom 1, a VHS domain-containing protein, interacts with Tollip, ubiquitin, and clathrin."Journal of Biological Chemistry. 278・52. 52865-82872 (2003)
• [Publications] Sachiko Tsukamoto: "New polyhydroxy sterols : proteasome inhibitors from a marine sponge Acanthodendrilla sp."Journal of Natural Products. 66・9. 1181-1185 (2003)
• [Publications] Hitoshi Sawada: "Extracellular ubiquitination and proteasome-mediated degradation of the ascidian sperm receptor"Proceedings of National Academy of Sciences, USA. 99. 1223-1228 (2002)
• [Publications] Hitoshi Sawada: "Localization and roles in fertilization of sperm proteasomes in the ascidian Halocynthia roretzi"Molecular Reproduction and Development. 62. 271-276 (2002)
• [Publications] Yuhsuke Kikukawa: "The 26S proteasome Rpn10 gene encoding splicing isoforms : Evolutional conservation of genomic organization in vertebrates"Biological Chemistry. 383. 1257-1261 (2002)
• [Publications] Yasushi Saeki: "Ubiquitin-like proteins and Rpn10 play cooperative roles in ubiciuitin-dependent proteolysis"Biochemical and Biophysical Research Communications. 293. 986-992 (2002)
• [Publications] Yasushi Saeki: "Identification of ubiquitin-like protein-binding subunits of the 26S proteasome"Biochemical and Biophysical Research Communications. 296. 813-819 (2002)
• [Publications] Koji Takada: "Isolation of ubiquitin-E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) complexes from erythroleukaemia cells using immunoaffinity techniques"Biochemical Journal. 356・1. 199-206 (2001)
• [Publications] Eri Kodama: "cDNA cloning and functional analysis of ascidian sperm proacrosin"Journal of Biological Chemistry. 276・27. 24594-24600 (2001)
• [Publications] Hitoshi Sawada: "Extracellular ubiquitination and proteasome-mediated degradation of the ascidian sperm receptor"Proceedings of National Academy of Sciences, USA. 99・3. 1223-1228 (2002)
• [Publications] Eri Kodama: "Spermosin, a trypsin-like protease from ascidian sperm : cDNA cloning, protein structures and functional analysis"European Journal of Biochemistry. 269・2. 657-663 (2002)
• [Publications] Hitoshi Sawada: "Localization and roles in fertilization of sperm proteasomes in the ascidian Halocynthia roretzi"Molecular Reproduction and Development. (印刷中). (2002)
• [Publications] Hiroyuki Kawahara: "Developmentally regulated, alternative splicing of the Rpn10 gene generates multiple forms of 26S proteasomes."EMBO Journal. 19・15. 4144-4153 (2000)
• [Publications] Hiroyuki Kawahara: "Inhibiting proteasome activity causes overreplication of DNA and blocks entry into mitosis in sea urchin embryos."Journal of Cell Science. 113・15. 2659-2670 (2000)