短寿命活性種をシグナルとするセンサー蛋白質の構造と機能

• Project/Area Number: 12147205
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 小林 一雄 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (30116032)
• Project Period (FY): 2000 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥27,600,000 (Direct Cost: ¥27,600,000); Fiscal Year 2004: ¥5,900,000 (Direct Cost: ¥5,900,000); Fiscal Year 2003: ¥6,000,000 (Direct Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2002: ¥6,800,000 (Direct Cost: ¥6,800,000); Fiscal Year 2001: ¥8,900,000 (Direct Cost: ¥8,900,000)
• Keywords: 酸化ストレス / 転写因子 / 鉄イオウクラスター / SoxR / X線構造解析 / NMR / P.aeruginosa / Vibrio cholera / Pseudomonas aeruginosa / E.coli / X線結晶解析 / スーパーオキサイドアニオン / 金属センサー / 短寿命活性種 / パルスラジオリシス / 活性酸素 / X線結晶構造解析 / 転写制御

Research Abstract

酸化ストレスが増大するど、防御修復系タンパク質の活性誘導される現象が広く生物界に見られる。大腸菌において、スーパーオキサイドアニオン産生に応答する遺伝子の発現調節に関わる調節因子であるSoxRが単離されている。SoxRは、転写制御部位に鉄イオウクラスターを持ち、その酸化還元により転写調節するというユニークな性質を有し、その特異な構造と機能は注目される。本研究では、大腸菌におけるSoxRに依存した酸化ストレス応答の分子機構を明らかにすることを目的としてSoxRのX線構造解析を目的として結晶化を試みてきた。その結果得られた結晶を用いて、X線回折実験を行ったところ、最高で3.8Å分解能を超え,る反射が確認できた。またSoxRの鉄イオウクラスタードメインのNMRによる測定を行い、現在まで知られている鉄イオウクラスターとは全く異なるスペクトルを得られ、その特異な構造が示唆された。このSoxRと同様なアミノ酸配列を持つタンパク質が種々のバクテリアにも存在している。しかしながらE.coliと異なり、いずれのバクテリアにおいても酸化ストレス応答に必要なもうひとつの転写因子であるSoxSが存在しない。またsoxRの5'上流にSoxRタンパク質の結合領域と相同の配列と未知のタンパク質のORFが存在している。そこで、本研究では、P.aeruginosaおよびVibrio choleraにおけるSoxRを大量発現、精製を行い、その機能について調べた。いずれののSoxRは鉄イオウクラスターに特徴的な吸収スペクトルを持ち、またその酸化還元電位もE.coliと同様な値を示した。精製したタンパクはSoxR配列の5'上流に存在するE.coliにおけるsoxSプロモーターと同様な配列を持つDNA fragmentに結合することがfluoresence polarizationにより確かめた。またP.aeruginosaのすぐ上流に存在する未知のタンパク質のin vitroでの転写活性が見られ、この活性がSoxRの酸化運元により制御されていることが分かった。以上の結果より、SoxRは酸化ストレス以外の多様な応答遺伝子として働いていることが明らかになった。

Research Products

• [Journal Article] 酸化ストレスに応答して働くセンサー蛋白質 (2005)
  • Author(s): 小林一雄
  • Journal Title: 化学と教育 (印刷中)
• [Journal Article] Activation of SoxR-Dependent Transcription in Pseudomonas aeruginosa (2004)
  • Author(s): K.Kobayashi, S.Tagawa
  • Journal Title: J.Biochem. 136 Pages: 607-615
  • NAID: 10016203449
• [Publications] Kazuo Kobayashi, Seiichi Tagawa: "Direct Observation of Guanine Radical Cation Deprotonation in Duplex DNA Using Pulse"J.Amer.Chem.Soc.. 125. 10213-10218 (2003)
• [Publications] 小林一雄, 田川精一: "DNA放射線損傷 -放射線照射直接効果のモデル化"放射線化学会誌. 印刷中.
• [Publications] F.Takeuchi, K.Kobayashi, S.Tagawa, M.Tsubaki: "Ascorbate Protects the Carbethoxylation of Two Histidyl and One Tyrosyl Residues Indispensable for the Transmembrane Electron Transfer Reaction of Cytochromeb_<561>"Biochemistry. 41. 4067 (2001)
• [Publications] K.Kobayashi, A.Koppenhofer, S.J.Ferguson, N.J.Watmough, S.Tagawa: "Intramolecular Electron Transfer from c Heme to d_1 Heme in Bacterial Cytochrome cd_1 Nitrite Reductase Occurs over the Same Distances at very Different Rates Depending on the Source of the Enzyme"Biochemistry. 41. 8542 (2001)
• [Publications] H.Nakajima, E.Nakagawa, K.Kobayashi, S.Tagawa, S.Aono: "Ligand-Switching intermediates for the CO-Sensing Transcriptional Activator CooA Measured by Pulse Radiolysis"J.Biol.Chem.. 276. 37895 (2001)
• [Publications] K.Kobayashi, S.Tagawa, S.Daff, I.Sagami, T.Shimizu: "Rapid Calmodulin-Dependent Interdomain Electron Transfer in Neuronal Nitric-Oxide Synthase Measured by Pulse Radiolysis"J.Biol.Chem.. 276. 39864 (2001)
• [Publications] M.Tsubaki,K.Kobayashi,T.Ichise,F.Takeuchi,and S.Tagawa: "Diethylpyrocarbonate-Modification Abolishes Fast Electron Accepting Ability of Cytochrome b_<561> from Ascorbate but Does Not Influence on Electron Donation to Monodehydroascorbate Radical"Biochemistry. 39. 3276 (2000)
• [Publications] S.Suzuki,H.Furusawa,K.Kataoka,K.Yamaguchi,K.Kobayashi,S.Tagawa: "Intramolecular Electron Transfer Process of Native and Mutant Forms of Blue Copper-containing Nitrite Reductase from Alcaligenes xylosoxidans"Inorg.Reac.Mech.. 135. 2129 (2000)
• [Publications] T.Hirano M.Hirobe,K.Kobayashi,O.Yamauchi,Y.Satow,and T.Nagano: "Mechanism of Superoxide Dismutase-Like Activity of Fe (II) and Fe (III) Complexes of Tetrakis-N,N,N',N'(2-pyridylmethyl) ethylenediamine"Chem.Pharm.Bull.. 48. 223 (2000)
• [Publications] S.Fujii,K.Kobayashi,S.Tagawa,and T.Yoshimura: "Reaction of Nitric Oxide with Iron (III) Complex of N-(Dithiocarboxy) sarcosine"J.Chem.Soc.Dalton Trans.. 3310 (2000)
• [Publications] K.Kobayashi,S.Tagawa, and T.Mogi: "Transient Formation of Ubisemiquinone Radical and Subsequent Electron Transfer Process in the Escherichia coli Cytochrome bo"Biochemistry. 40. 15620 (2000)