| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,900,000)
Fiscal Year 2000: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,900,000)
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| Research Abstract |
リンパ球、特にNK細胞の活性化分子を明らかにする目的で、NFAT-GFPレポーター遺伝子とレトロウィルスcDNAライブラリーを用いた新たな遺伝子クローニング法を確立した。レトロウィルスベクターを用いたcDNAライブラリーは、様々な細胞に遺伝子導入することができ、さらに遺伝子の発現が持続的であるため機能的スクリーニングを可能にする。一方、スクリーニング用の細胞としてレポーター遺伝子NFAT-GFPを導入し、TCR等の刺激に対してGFPを発現するT細胞ハイブリドーマを作成した。この細胞に、cDNAがCD8とのキメラ分子として発現するように設計したレトロウィルスライブラリーを導入し、抗CD8抗体で活性化された時に、GFP陽性となる細胞をソーティングにて採取し、クローニングした。その結果、脾臓のライブラリーからはIgα,Igβ,CD3ε,ZAP70,Syk等の分子、NK細胞のライブラリーからはFcRγ,DAP12,ZAP70等既にシグナル伝達分子として知られているものが同定され、本手法(NACSと呼ぶ)はリンパ球の活性化分子の探索に有用であることが分かった。加えて、新規分子として細胞表面分子NFAT activating Molecule 1(NFAM1)が見いだされた。NFAM1は細胞内部位にITAM用の配列YxxLx(7-8)YxxMを持ち、リンパ細胞にNFAM1を遺伝子導入すると、NFAT-GFPレポーターを活性化することができた。さらに、このITAM様部位のチロシン(Y)をフェニルアラニンに置換すると、活性化シグナルを伝えないことから、このITAM様部位はNFAM1のシグナル伝達に必須の領域である。NK細胞のcDNAライブラリーからもいくつが未知の分子がクローニングされた。今後は、これら新規分子についても解析を進め、NK細胞の活性化機構を明らかにするとともに、NFAM1の機能について解析を進める予定である。
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