アポトーシスにおけるp27^<kip1>の分解制御と細胞死シグナルの相互作用の探究

• Project/Area Number: 12215008
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 海野 倫明 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (70282043)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 正徳 東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (70206530) ; 片寄 友 東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (20302151)
• Project Period (FY): 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥4,700,000 (Direct Cost: ¥4,700,000); Fiscal Year 2000: ¥4,700,000 (Direct Cost: ¥4,700,000)
• Keywords: p27kip1 / アポトーシス / Fas / Fas lignd / TFK-1 / TUNELアッセイ / アデノウイルス

Research Abstract

我々はCDK inhibitorの1つであるp27/kip1を発現したアデノウイルス(以下Adp27)が,各種腫瘍細胞培養株に対してapoptosisを誘導することを報告し,p27/kip1が癌抑制遺伝子類似の機能を有することを提唱してきたが,そのメカニズムは不明のままであった.平成12年度の研究成果として,p27/kip1によるapoptosis誘導のメカニズムの一端をFas/Fas ligand systemの面から解析した.
(1)Adp27感染72時間後にTUNEL assayを施行した結果,対象群に対して明らかな右方シフトを示し,Adp27感染によるapoptosis誘導を確認した.
(2)Adp27感染前では胆管癌細胞表面にFas発現を認めたがFas ligand発現は認めなかった.一方,p27感染48時間後では明らかなFas ligandの発現を認め,Adp27によるapoptosis誘導にFas pathwayが関与することが示唆された。
(3)コントロールとしてp27と同じCDK inhibitorであるp21をアデノウイルスを用いて細胞内に導入し,同様にフローサイトメトリーにてFas ligandの細胞表面への発現を確認したが,Adp21感染後にはFas ligandの発現は全く認められなかった.
(4)Fas ligandの中和抗体であるNOK1を添加しTUNEL assayを施行した.Adp27感染後の添加でもapoptosisがほぼ完全に抑制され,p27/kip1によって誘導されるapoptosisがFas/Fas ligand systemを主要経路とすることが確認された.
(5)Western blot,RT-PCRでFas ligand発現誘導を確認したが,Adp27感染後もde novoとしてのFas ligandタンパクやFasL mRNA発現量に変化は認められなかった.
以上より,p27/kip1によるアポトーシス誘導にFas/Fas ligand systemが深く関与していることが明らかとなった.p27/kip1によるFas ligandの細胞表面の発現はde novo Fas ligandの誘導を伴わず,その局在を細胞内から表面へ変化させることでアポトーシスのトリガーとしている可能性が示唆された。

Research Products

• [Publications] Kim,M.,Katayose,Y., et al.: "Adenovirus expressing cyclin dependent kinase inhibitor p27 induces apopotosis for cholangiocarcinoma cell lines through ICE family pathway. Induction of apoptosis in p16INK4A mutant cell lines by adenovirus-mediated overexpression of p16INK4A protein."Cell Death Differ. 7(8) . 706-11 (2000)
• [Publications] Takemura,S.,Katayose,Y., et al.: "Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding system."Protein Eng.. 13(8). 583-8 (2000)
• [Publications] Suzuki,M.,Unno,M.,Katayose,Y. et al.: "Detection of perfusion areas of the gallbladder vein on computed tomography during arterial portography (CTAP)-the background for dual S4a.S5 hepatic subsegmentectomy in advanced gallbladder carcinoma"Hepatogastroenterology. 47(33). 631-5 (2000)
• [Publications] Takemura,S.,Katayose,Y., et al.: "Functional Fv fragment of an antibody specific for CD28: Fv-mediated co-stimulation of T cells"FEBS Lett. 476(3). 266-71 (2000)
• [Publications] Asano,R.,Katayose,Y. et al: "Functional construction of the anti-mucin core protein (MUCI) antibody MUSEII variable regions in a bacterial expression system"J Biochem (Tokyo). 127(4). 673-9 (2000)