アポトーシスにおけるp27^<kip1>の分解制御と細胞死シグナルの相互作用の探究

Research Project

Project/Area Number	12215008
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	海野倫明東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (70282043)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	鈴木正徳東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (70206530) 片寄友東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (20302151)
Project Period (FY)	2000
Project Status	Completed (Fiscal Year 2000)
Budget Amount *help	¥4,700,000 (Direct Cost: ¥4,700,000) Fiscal Year 2000: ¥4,700,000 (Direct Cost: ¥4,700,000)
Keywords	p27kip1 / アポトーシス / Fas / Fas lignd / TFK-1 / TUNELアッセイ / アデノウイルス
Research Abstract	我々はCDK inhibitorの1つであるp27/kip1を発現したアデノウイルス(以下Adp27)が,各種腫瘍細胞培養株に対してapoptosisを誘導することを報告し,p27/kip1が癌抑制遺伝子類似の機能を有することを提唱してきたが,そのメカニズムは不明のままであった.平成12年度の研究成果として,p27/kip1によるapoptosis誘導のメカニズムの一端をFas/Fas ligand systemの面から解析した. (1)Adp27感染72時間後にTUNEL assayを施行した結果,対象群に対して明らかな右方シフトを示し,Adp27感染によるapoptosis誘導を確認した. (2)Adp27感染前では胆管癌細胞表面にFas発現を認めたがFas ligand発現は認めなかった.一方,p27感染48時間後では明らかなFas ligandの発現を認め,Adp27によるapoptosis誘導にFas pathwayが関与することが示唆された。 (3)コントロールとしてp27と同じCDK inhibitorであるp21をアデノウイルスを用いて細胞内に導入し,同様にフローサイトメトリーにてFas ligandの細胞表面への発現を確認したが,Adp21感染後にはFas ligandの発現は全く認められなかった. (4)Fas ligandの中和抗体であるNOK1を添加しTUNEL assayを施行した.Adp27感染後の添加でもapoptosisがほぼ完全に抑制され,p27/kip1によって誘導されるapoptosisがFas/Fas ligand systemを主要経路とすることが確認された. (5)Western blot,RT-PCRでFas ligand発現誘導を確認したが,Adp27感染後もde novoとしてのFas ligandタンパクやFasL mRNA発現量に変化は認められなかった. 以上より,p27/kip1によるアポトーシス誘導にFas/Fas ligand systemが深く関与していることが明らかとなった.p27/kip1によるFas ligandの細胞表面の発現はde novo Fas ligandの誘導を伴わず,その局在を細胞内から表面へ変化させることでアポトーシスのトリガーとしている可能性が示唆された。