がん治療をめざしたアデノウイルスベクターを用いた発現制御法の開発

• Project/Area Number: 12217028
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 斎藤 泉 東京大学, 医科学研究所, 教授 (70158913)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鐘ヶ江 裕美 東京大学, 医科学研究所, 助手 (80251453) ; 小澤 敬也 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707) ; 多比良 和誠 東京大学, 工学系研究科, 教授 (10261778) ; 伊庭 英夫 東京大学, 医科学研究所, 客員教授 (60111449)
• Project Period (FY): 2000 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥171,000,000 (Direct Cost: ¥171,000,000); Fiscal Year 2004: ¥30,000,000 (Direct Cost: ¥30,000,000); Fiscal Year 2003: ¥30,400,000 (Direct Cost: ¥30,400,000); Fiscal Year 2002: ¥30,000,000 (Direct Cost: ¥30,000,000); Fiscal Year 2001: ¥30,600,000 (Direct Cost: ¥30,600,000); Fiscal Year 2000: ¥50,000,000 (Direct Cost: ¥50,000,000)
• Keywords: アデノウイルスベクター / guttedベクター / 部位特異的組換え酵素 / Cre / loxP / FLP / FRT / 遺伝子治療 / 遺伝子置換反応 / ウイルスベクター / 発現制御 / アデノウイルス / ウィルスベクター / 遺伝子置換 / アデノウィルス / レトロウイルスベクター / リボザイム

Research Abstract

がんの遺伝子治療の実用化に向けて本研究ではがん細胞特異的高度発現機能を有する改良型アデノウイルスベクターとして、がん細胞特異的プロモーターから部位特異的組換え酵素を発現する「制御ユニット」と強力なプロモーターからの目的遺伝子の発現をOFFからONへと制御する「発現標的ユニット」を一つのウイルスベクターに組み込む「単一型特異的高度発現ベクター」作製法の開発を行ってきた。このベクターにはヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクター(guttedベクター)を応用するため、guttedベクターの効率的な作製法の開発が必須であり、部位特異的組換え酵素の遺伝子置換反応を応用した全く新しいベクター作製法の開発に取り組んでいる。一般的に発現効率が劣る細胞特異的プロモーターからの発現量を確保するために、制御ユニットには組換え効率が高いCreの応用が必須であり、ベクター作製にはFLPを応用する必要性が生じたが、FLPは組換え効率がCreと比べ劣るためFLPの改良を行ってきた。本年度はFLPの温度安定型として報告された4アミノ酸変異体FLPeと本研究で我々が新規に合成し作製したFLPeのcodon usageをヒト型化したhFLPeの組換え効率をFLPと詳細に比較した。新たに作製したペプチド抗体を用いた解析からhFLPeのタンパク質量はFLPと比べ数十倍上昇していたことが明らかとなったが、組換え効率はFLPやFLPeとほぼ同程度であり、高度に発現したFLPは細胞への影響を示す可能性が示唆された。しかし本研究で樹立化したFLPやhFLPe発現293細胞は、予想に反してCre発現293細胞よりも高い組換え効率とベクター生成効率を示しており、これらの細胞株を用いることでguttedベクター作製の高効率化が図られるものと考えている。

Research Products

• [Journal Article] Prolonged skin allograft survival by IL-10 gene-introduced CD4 T cell administration. (2005)
  • Author(s): Miyamoto, T., Saito, I.et al.
  • Journal Title: Int.Immunol. (in press)
  • NAID: 10019358742
• [Journal Article] Practical range of effective dose for Cre recombinase-expressing recombinant adenovirus without cell toxicity in mammalian cells. (2005)
  • Author(s): Baba, Y., Saito, I.et al.
  • Journal Title: Microbiol.Immunol. 49・6(in press)
  • NAID: 10016132286
• [Journal Article] The testicular fatty acid binding protein PERF15 regulates the fate of germ cells in PERF15 transgenic mice. (2005)
  • Author(s): Kido, T., Saito, I.et al.
  • Journal Title: Dev Growth Differ. 47 Pages: 15-24
  • NAID: 10014431734
• [Publications] Kondo, S.et al.: "Simultaneous on/off regulation of transgenes located on a mammalian chromosome with Cre-exoressing adenovirus and a mutant loxP"Nucleic Acids Res.. 31. 76 (2003)
• [Publications] Horie, R. et al.: "Ligand-independent signaling by overexpressed CD30 drives NF-kappaB activation in Hodgkin-Reed-Sternberg cells"Oncogene. 21. 2493-2503 (2002)
• [Publications] Kim, J.M.et al.: "Inactivation of Cdc7 kinase in mouse ES cells results in S-phase arrest and p53-dependent cell death"Embo J.. 21. 2168-2179 (2002)
• [Publications] Yamamoto, H. et al.: "Enhanced skin carcinogenesis in cyclin D1-conditional transgenic mice : cyclin D1 alters keratinocyte response to calcium-induced terminal differentiation"Cancer Res.. 62. 1641-1647 (2002)
• [Publications] Yamamoto, H. et al.: "HST-1/FGF-4 gene activation induces spermatogenesis and prevents adriamycin-induced testicular toxicity"Oncogene. 21. 899-908 (2002)
• [Publications] Nakano, M. et al.: "DNA substrates influence the recombination efficiency mediated by FLP recombinase expressed in mammalian cells"Microbiol Immunol. 45. 657-665 (2001)
• [Publications] Nakano, M. et al.: "Efficient gene activation in cultured mammalian cells mediated by FLP recombinase-expressing recombinant adenovirus"Nucleic Acids Res.. 29. E40 (2001)
• [Publications] Sakai, Y. et al.: "Gene therapy for hepatocellular carcinoma using two recombinant adenovirus vectors with alpha-fetoprotein promoter and Cre/lox P system"J Virol Methods. 92. 5-17 (2001)
• [Publications] Takehara, M. et al.: "Long-term acceptance of allografts by in vivo gene transfer of reguiatable adenovirus vector containing CThA4IgG and loxP"Hum Gene Ther.. 12. 415-426 (2001)
• [Publications] Takiguchi,M. et.al.: "CTLA4IgG gene delivery prevents autoantibody production and lupus nephritis in MRL/lpr mice."Life Sci.. 66. 991-1001 (2000)
• [Publications] Wakita,T. et,al.: "Possible role of cytotoxic T cells in acute liver injury in hepatitis C virus cDNA transgenic mice mediated by Cre/loxP system."J.Med.Virol. 62. 308-317 (2000)
• [Publications] Sakai,Y. et.al.: "Gene therapy for hepatocellular carcinoma using two recombinant adenovirus vectors with alpha-fetoprotein promoter and Cre/lox P system."J.Virol.Method. (in press). (2001)
• [Publications] Nakano,M. et.al.: "Efficient gene activation in cultured mammalian cells mediated by FLP recombinase-expressing recombinant adenovirus."Nucl.Acids Res.. (in press). (2001)
• [Publications] Ui,M. et.al.: "Endogenous AP-1 levels necessary for oncogenic activity are higher than those sufficient to support normal growth."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 278. 97-105 (2000)
• [Publications] Warashina,M. et.al.: "Novel RNA-protein hybrid ribozymes efficiently cleave any mRNA independently of the structure of the target RNA."Proc.Natl.Acad.Su.USA. (in press). (2001)