| Project/Area Number |
12480199
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Research Field |
Biophysics
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
神山 勉 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (30170210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
倭 剛久 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90251587)
垣谷 俊昭 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (90027350)
村上 緑 名古屋大学, 大学院・工学研究科, 助手 (20324387)
足立 伸一 理化学研究所, 播磨研究所, 先任研究員 (60260220)
神谷 信夫 理化学研究所, 播磨研究所, 室長 (60152865)
井原 邦夫 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 助手 (90223297)
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| Project Period (FY) |
2000 – 2001
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2001)
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| Budget Amount *help |
¥9,200,000 (Direct Cost: ¥9,200,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2000: ¥7,300,000 (Direct Cost: ¥7,300,000)
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| Keywords | X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / バクテリオロドプシン / アーキロドプシン / 光駆動プロトン輸送 / 蛋白質の結晶化 / 生体膜 / 反応中間体 / 膜蛋白質の結晶化 / 脂質-蛋白質間相互作用 / シンクロトロン放射光 |
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| Research Abstract |
光駆動プロトンポンプとして知られるバクテリオロドプシンの反応中間体の立体構造を求めることを目指して研究を行った。これまでに、膜融合を利用して膜蛋白質を結晶化することを試み、脂質分子を含んだバクテリオロドプシンの三次元結晶を作成する技術の開発を行ってきたが、本研究においては、この結晶化法を改良し、構造解析の分解能を2.3オングストロームまで向上させた。これにより、蛋白質に結合した脂質の構造および活性部位の水分子の位置を求めることができた。また、バクテリオロドプシンの反応中間体の構造解析を行うため、単結晶のX線回折と吸収スペクトルの同時測定を行うための装置も作成し、低温下での光照射により結晶中に蓄積した中間体の量を高精度で求める方法を確立した。このような開発研究を積み重ねる中で、蛋白質結晶のX線損傷が従来考えられてきたより遥かに少量のX線照射量により引き起こされることを見出した。この結果を踏まえ、X線損傷の影響を軽減できる低温X線回折測定法を開発し、反応サイクルの初期に現れるK中間体についての信頼度の高い回折データを得た。構造解析の結果、反応サイクル初期に引き起こさせる構造変化は発色段レチナールのシッフ塩基近傍に限定されることが示された。また、反応サイクルの後半に現れるM中間体についても構造解析の精度を高め、蛋白質を構成する7本のヘリックスのうち一本(Gヘリックス)が膜面に垂直方向にスライドすることを確認するとともに、活性部位における水分子の動きも明らかにした。さらに、K中間体が熱緩和して生じるL中間体についても構造解析を行い、構造変化の認められる領域が細胞外側方向に広がることを明らかにした。また、バクテリオロドプシンと類似の蛋白質であるアーキロドプシンの結晶化を行い、4オングストロームの分解能の回折データを収集した。まだ解析途上であるが、アーキロドプシン4量体が集積して結晶ができていることが示唆されている。
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