ドミナントネガティブ体を用いた膜型1マトリックスメタロプロテアーゼの機能解析

• Project/Area Number: 12680626
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 伊藤 義文 東京大学, 医科学研究所, 助手 (70292852)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2001: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000); Fiscal Year 2000: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
• Keywords: 癌細胞 / 浸潤・転移 / 膜型マトリックスメタロプロテアーゼ / MMPの活性化 / MT1-MMP / 2量体 / proMMP-2

Research Abstract

可溶型のMMP2は潜在型として組織中に存在するが、活性化に際しては細胞の表面に濃縮される。この際にTIMP-2が、N末のインヒビタードメインにてMT1-MMPと結合し、C末のドメインにて潜在型MMP-2の結合することによって、MT1-MMP発現細胞に潜在型MMP2が結合する為のアダプターの役割を果たす。複合体中のMT1-MMPは抑制状態にあるためにMMP2の活性化はできない。そこで近接した位置にありアクチベーター役として働くもう1分子のMT1-MMPが必要である。このような2分子のMT1-MMPが近接する仕組みを検証した。リコンビナント酵素のゲルろ過による精製過程で、MT1-MMPが見かけの分子量の整数倍の位置に溶出することを見出した。このような複合体形成はPEXドメインに依存した。実際の細胞上でもこのような複合体が形成されていことは、FLAGおよびMyc-tagで標識した分子を同時に発現して、抗FLAG抗体によってMyc-tag標識した分子が共沈すること、また、逆の実験が成立することで示された。PEXドメインを欠いた変異体MT1-MMPには複合体系性能はなく、同時にMMP-2の活性化能も失っていた。次に、細胞外領域はMT1-MMPに由来し、細胞膜貫通および細胞内ドメインは神経成長因子受容体(NGF-R)に由来するキメラ蛋白質を細胞に発現させて、MT1-MMPのホモ複合体形成を可視化することを試みた。MT1-MMPは細胞運動に際して運動の先進部に局在することが知られている。細胞に活性型Racを発現させて、MT1-MMPがラメリポデイアに局在するような状況を作ってやると、NGF-Rのリン酸化が細胞外のPEXドメインに依存して同様の場所で引き起こされることを確認した。同時にMMP-2の活性化も誘導されることが確認された。

Research Products

• [Publications] Itoh Y, Takamura A, Ito N, Maru Y, Sato H, Suenaga N, Aoki T, Seiki M.: "Homophilic complex formation of MT1-MMP facilitates proMMP-2 activation on the cell surface and promotes tumor cell invasion"The EMBO Journal. 20. 4782-4793 (2001)
• [Publications] Oh A, Itoh Y, 他17名: "The membrane-anchored MMP-inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis"Cell. 107. 789-780 (2001)
• [Publications] Itoh Y,Kajita M,Kinoh H,Mori H,Okada A,Seiki M: "Membrane-type 4 matrix metalloproteinase (MT4-MMP,MMP-17) is a glycosyl-phosphatidyl inositol (GPI)-anchored proteinase."J.Biol.Chem.. 274. 34260-34266 (1999)
• [Publications] Nabeshima K,Inoue T,Shimao Y,Okada Y,Itoh Y,Seiki M,and Koono M: "Front-cell-specific expression of membrane-type I matrix metalloproteinase and gelatinase A during cohort migration of colon carcinoma cells induced by hepatocyte growth factor/scatter factor."Cancer Res. 60. 3364-3369 (2000)
• [Publications] Kojima S,Itoh Y,Matsumoto S,Masuho Y,and Seiki M: "Membrane-type 6 matrix metalloproteinase (MT6-MMP, MMP-25) is the second glycosyl-phosphatidyl inositol (GPI) -anchored MMP"FEBS Letters. 480. 142-146 (2000)