| Budget Amount *help |
¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Research Abstract |
モノクローナル抗体の作製
オーシスト破砕液またはスポロゾイトのホモジェネートで免疫したマウスから脾臓を摘出し,PEG法でハイブリドーマを作製した。スクリーニングELISAにはスポロゾイトのホモジェネート標品(SH)を吸着させたプレートとオーシスト壁標品(OW)を吸着させたプレートを用いた。その結果,スポロゾイト抗体の侯補として7クローンが選択された。これらのクローンからFITC標識抗体を作製し,脱嚢処理したクリプトスポリジウムの染色性を観察したところ,3抗体はスポロゾイトに対する特異性が高かったが,オーシスト壁も若干染色されてしまった。残り4抗体は特異性が認められなかった。
脱嚢法の最適化
タウロコール酸ナトリウムとトリプシン混合溶液(T液)およびデシキシコール酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウム混合溶液(D液)を用いてフローサイトメトリーに適する脱嚢法を検討した。その結果,D液は脱嚢したスポロゾイトの消失時間がT液に比べて短いが,フローサイトメーターで計測した場合のバックグラウンドが低かった。また,脱嚢したスポロゾイト数が最大になる培養時間は60分であった。この結果から,D液で60分間培養する脱嚢法が適していると判断した。
測定条件の設定
オーシストに紫外線を照射し,脱嚢率を50%にコントロールした試料と紫外線を照射しなかった試料(脱嚢率100%)を前述の脱嚢法で処理し,スポロゾイト抗体候補で染色してからフローサイトメーターで計測した。その結果,3抗体ともにポリクローナル抗体で染色した場合と差は認められず,スポロゾイトとオーシスト壁の染色性の差を弁別して検出することはできなかった。
しかし,脱嚢後の「オーシスト壁」数に対する「スポロゾイト」数の比は理論比よりも10%程度低くなる傾向が認められたものの,前方散乱光と側方散乱光との座標領域の設定により弁別できることが明らかとなった。
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