炭酸固定を触媒する微生物脱炭酸酵素によるCO_2の分子変換

• Project/Area Number: 12760050
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 吉田 豊和 岐阜大学, 工学部, 助教授 (90220657)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000); Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2000: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: 脱炭酸酵素 / 炭酸固定反応 / 微生物触媒 / 芳香族カルボン酸 / クローニング / ピロール / インドール / 微生物機能開発

Research Abstract

脱炭酸酵素は逆反応で炭酸固定を触媒しないとされているが、Bacillus metarerium PYR2910に見いだしたピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素は炭酸固定をも触媒する新規酵素である。ピロールへの炭酸固定活性に注目すると、化学合成では困難な位置特異的な炭酸固定反応を触媒することから、二酸化炭素の分子変換への応用も可能である。しかしながら、ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素の酵素構造・反応機構に関する知見は全くない。一方、類縁の酵素反応を探索をした結果、ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素はSerratia属細菌にも分布していること、インドール3-カルボン酸脱炭酸酵素も可逆的に反応を触媒することがこれまでに明らかとなってきた。そこで、これらの新しい脱炭酸酵素群の分子および反応特性を解明するために、ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニングとその解析を進めた。インドール-3-カルボン酸脱炭酸酵素については、酵素を精製し性質の解明を行った。
ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素をB.megaterium PYR2910およびS.grimesii IFO13537から精製し、プロテインシーケンシングによってアミノ酸配列の一部を得た。この配列に基づき、PCRによってそれぞれの部分遺伝子断片を増幅させ、増幅断片をプローブとしてピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素遺伝子をクローニングした。2種類の細菌の酵素一次構造は、これまで機能未知であった数多くの微生物タンパク質と20〜50%の相同性を示し、保存性の高い配列が数ヶ所認められた。近傍領域の解析ではピロールの代謝に関与する遺伝子群は認められなかったが、桂皮酸誘導体の脱炭酸酵素と高い相同性を示すタンパク質がコードされていた。B.megaterium PYR2910の遺伝子を大腸菌内で発現させ、野生型酵素と同じ特性を有することを示した。
インドール-3-カルボン酸脱炭酸酵素は極めて酸素感受性であり、反応には不安定なSH基が関与することが示唆された。ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素(ホモダイマー)とほぼ同一のサブユニット分子量を有し、一次構造の類似性が推察されるが、未変性酵素はホモテトラマーであった。精製酵素はインドールへの炭酸固定以外に、数種のインドール誘導体、キノキサリンにも作用し、相当するカルボン酸を生成した。