ピロロキノリンキノン依存性メタノール脱水素酵素の活性発現に必要な遺伝子群解析

• Project/Area Number: 12760058
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 外山 博英 山口大学, 農学部, 助教授 (60240884)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000); Fiscal Year 2001: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2000: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: メタノール脱水素酵素 / ピロロキノリンキノン / PQQ / メチロトロフ / ペリプラズム

Research Abstract

Methylobacterium extorquens AM1はメタノールを唯一の炭素源として生育する際、キノプロテインメタノール脱水素酵素(MDH)を発現し酸化を行なう。MDHの活性発現には30以上の遺伝子が必要とされ、ゲノム中でいくつかのクラスターを形成している。その中で最も大きなクラスターがmxaFJGIR(S)ACKLDEHB遺伝子群で、いくつかの遺伝子は機能が未解明である。そのひとつであるmxaD遺伝子について解析した。mxaDが欠損すると、粗酵素抽出液中のMDH活性は野生株以上に強いにもかかわらず、生菌体のメタノール酸化活性は著しく減少した。変異株からMDHとその電子受容体であるチトクロムc_Lを精製し、酵素化学的性質等について検討した。変異株からの精製MDHは吸収スペクトルが野生型と異なり、360nm付近の吸収が減少していた。電子共鳴スピンでは野生型と同じ波形を示したが、シグナル強度は野生型の約9倍であった。補欠分子族であるピロロキノリンキノンが、野生型では10%程度がセミキノン型で、変異株からのMDHではほぼ100%であると推定された。精製チトクロムc_Lの酸化還元電位は、野生型、変異株からのものどちらも約250mVであった。人工電子受容体であるフェナジンメトサルフェートを使った場合にはどちらの精製MDHでも活性に違いはなかったが、チトクロムc_Lを使い活性測定すると、変異株からの酵素は野生型に比べ著しく活性が低かった。MxaDはペリプラズム移行シグナルを有していることから、ペリプラズムでのMDH成熟過程に働くシャペロンか、メタノール酸化呼吸鎖の構成成分そのものであると考えられた。従来考えられていた呼吸鎖構成成分は4つであったが、再構成実験での活性は非常に低く、生体中での活性を十分には説明できていなかったので、見過ごされていた成分が発見されたと考えられる。