視細胞外節に対するエネルギー供給機構のin situ及び免疫細胞化学的解明

Research Project

Project/Area Number	12770004
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	General anatomy (including Histology/Embryology)
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	西沢祐治名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助手 (80252229)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	クレアチンキナーゼ / 視細胞 / ミトコンドリア / 免疫細胞化学 / ATP / クレアチンリン酸シャトル機構 / クレアチンリン酸
Research Abstract	視細胞のクレアチンリン酸シャトル機構を明らかにするために,ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(Mi-CK)に対する抗体を作製し,免疫細胞化学によって視細胞におけるクレアチンキナーゼの分布を検討した. ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ(Mi-CK)に対する抗体を作製するために,視細胞の全タンパク質を2次元電気泳動によって分離し,Mi-CKのタンパク質スポットを質量分析装置によって同定した.このスポットに含まれるタンパク質をPVDF膜に転写後,N末端配列をプロテインシークエンスして, cDNAから予測される配列と比較したところ,Mi-CKのミトコンドリアヘの移行シグナル(シグナルシークェンス)の存在が明らかになった.成熟タンパク質のN末端配列は脳型クレアチンキナーゼ(B-CK)や筋型クレアチンキナーゼ(M-CK)と全く異なっていたので,この部分の14アミノ酸配列(ASERRRLYPPSAEY)を抗原としてウサギ2羽に免疫した.現在免疫作業続行中であるが,抗体価測定のために中途採血した血液から作製した血清を用いて免疫細胞化学を行ったところ,作製したMi-CKに対する抗血清は視細胞のミトコンドリアをラベルし,バックグランドは比較的低かった.これによりプレリミテリーな結果であるが,視細胞のMi-CKはミトコンドリアのみに存在することがほぼ明らかになった.このことは視細胞のミトコンドリアと内接との間のクレアチンリン酸シャトル機構の成立を示唆し,さらに前年度に明らかにした外節・内接間のクレアチンリン酸シャトル機構の存在を支持するものである.