マイクロサテライトの不安定性を利用した遺伝子導入法の確立

• Project/Area Number: 12770250
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Gastroenterology
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 高橋 成一 東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (40312574)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2001: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 2000: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: マイクロサテライト / 遺伝子治療 / ジフテリア毒素 / アデニン塩基

Research Abstract

前年度作成したプラスミドベクターに、期待したジフテリア毒素A遺伝子の発現が認められなかったため、新たなべクターの作成を開始した。まず、前年度完全に欠失させたNsiIからHaeIIIまでの68bpについて、これを残してアデニン塩基を連続9塩基挿入したオリゴヌクレオチドを付加する方法と、68bpの5側領域約30塩基を残してアデニン塩基を連続9塩基挿入したオリゴヌクレオチドを付加する方法、さらに68bpの3側領域約30塩基を残してアデニン塩基を連続9塩基挿入したオリゴヌクレオチドを付加する方法の3つで、プラスミドを構築した。おのおの作成されたベクターは、ABI 310 Genetic Analyzerを用い直接シークエンス法で実際のジフテリア毒素A遺伝子の蛋白読み枠と合致することを確認した。
次に昨年同様にネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド上に、上記3種類の改変ジフテリア毒素A遺伝子を導入したベクターを作成した。コントロールベクターは、単純なジフテリア毒素A遺伝子を導入したものとした。これらをマウスES細胞にトランスフェクションし、ジフテリア毒素の発現を検討したところ、68bpのdeletionを行なわなかったベクターにわずかながら細胞死が確認され、期待しうるものと考えられた。なお、ネガティブセレクションには、ネオマイシンを使用した。現在この差異がより明らかとなるよう再度ベクターの構築を検討中である。