ニワトリDT40細胞を用いた非相同組換え機構の遺伝的解析

Research Project

Project/Area Number	12771409
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Biological pharmacy
Research Institution	Yokohama City University
Principal Investigator	足立典隆横浜市立大学, 木原生物学研究所, 助手 (30264675)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 2001: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 2000: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Keywords	非相同組換え / DT40 / ジーンターゲティング / エンドジョイニング / DNAライゲース / Ku / FEN-1 / DNAトポイソメラーゼ
Research Abstract	ニワトリBリンパ細胞株DT40を用いて,非相同組換えへの関与が示唆される遺伝子の破壊株(ホモ変異株)をジーンターゲティング法により作製し,解析を行った. 1.DNA ligase IV : DNA ligase IV遺伝子破壊株およびKu70遺伝子との二重破壊株の解析を引き続き行った.DNA ligase IVが,Kuに依存した非相同組換え(エンドジョイニング)の過程に必須の役割を果たしていることを明らかにした.また,これらの破壊株におけるランダムインテグレーションおよびジーンターゲティングの頻度を詳しく調べた. 2.DNA ligase III:ヘテロ変異株を取得し、解析を行った.また,ホモ変異株の取得を試みるとともに,DNA ligaseIIIが細胞増殖に必須である可能性を考慮し,条件致死変異株作製を試みた. 3.FEN-1:ホモ変異株を取得し,解析を行った.FEN-1はDNA複製に必須ではないが,塩基除去修復に必須であることを明らかにした.また,組換え,特にランダムインテグレーションにおけるFEN-1の役割についても調べた.さらに,DNAポリメラーゼβとの二重破壊株を作製するため,DNAポリメラーゼβ遺伝子をクローニング,導入ベクターを作製して破壊株の分離を試みた. 4.DNAトポイソメラーゼ(トポ)IIα:ヘテロ変異株の解析を引き続き行った.マウスES細胞での結果と同様,ヘテロ変異株の増殖速度は野生株と変わらなかったが,VP-16やICRF-193等のトポII阻害剤に対する感受性が低下していた.また,組換え,特にランダムインテグレーションにおけるトポIIαの役割についても調べた.