| Project/Area Number |
12771415
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Biological pharmacy
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
光本 篤史 北里大, 薬学部, 助手 (00276164)
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| Project Period (FY) |
2000 – 2001
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2001)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2001: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
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| Keywords | 一酸化窒素 / S-ニトロソグルタチオン / グリオキサラーゼI / グルタチオン / メチルグリオキサール / 2次元電気泳動 / プロテオミクス / 血管内皮細胞 |
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| Research Abstract |
申請者はヒト細胞内の糖代謝で派生する毒性物質メチルグリオキサールを解毒する酵素、グリオキサラーゼI(Glo I)がNO特異的かつ可逆的に酸化修飾され不活性化されることを蛋白質の2次元電気泳動法を用いた解析から見い出してきた。
本年度、Glo IとNOとのin vitroでの反応性について検討した結果、NO単独では反応せず、NOとグルタチオン(GSH)の付加体であるS-ニトロソグルタチオン(GSNO)と相互作用することを明かにした。また競合阻害剤の存在下ではその反応が完全に抑制されることから、Glo IとGSNOとの相互作用には酵素の気質認識部位が強く関与していることが示された。この結果はGlo Iがグルタチオン誘導体を基質とすることから、相互作用の場が基質認識部位である可能性を示している。細胞内GSHを1%以下に枯渇した条件ではNOに対するGlo Iの反応性が消失した。また細胞膜透過型のGlo I競合阻害剤によりGlo IのNO応答性は消失した。以上のことから、NOは細胞内でGSHと結合してGSNOとなり、Glo Iと反応するものと考えられる。
さらにNOの作用点を明かにするため、ヒトGlo I遺伝子のcDNAクローニングを行った。NOによる構造修飾が還元可逆的であることから、システイン残基(Cys)の寄与を考え、全部で4つのCysをそれぞれセリン(Ser)に変えたミュータントを作成した。現在までに、cDNAクローニングを終了し、シークエンサーにて配列を確認した。今後、組み換え蛋白質を発現精製し、NOに対する反応性を検討することによって、NOに対する作用点とその修飾構造について明かにしていく予定である。
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