| Project/Area Number |
12780442
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Bioorganic chemistry
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| Research Institution | Kobe Gakuin University (2001)
Tokyo University of Science (2000) |
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Principal Investigator |
水品 善之 神戸学院大学, 栄養学部, 講師 (20307705)
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| Project Period (FY) |
2000 – 2001
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2001)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2001: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
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| Keywords | 酵素特異的阻害剤 / DNAポリメラーゼβ / 長鎖脂肪酸 / リトコール酸 / 糖脂質 / 2次元NMR解析 / 立体構造解析 / 特異的阻害物質 / 分子プローブ / 有機化学合成 / DNA複製・修復 |
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| Research Abstract |
1.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインの大量発現
DNAポリメラーゼβ(polβ)・8kDaドメイン遺伝子のN末側にHis-タグを挿入して、その遺伝子を大腸菌へ組み込んだ。そして大腸菌を培養して遺伝子を発現させて、ニッケルカラムで簡単にかつ大量に8kDaドメインを供給することに成功した。培地に^<15>NH_4Clを添加して蛋白質を安定同位体ラベルすることにより、2次元NMR測定用の8kDaドメインサンプルを提供できるようにした。
2.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインと阻害剤の2次元HMQC-NMR解析
長鎖脂肪酸のリノール酸およびネルボン酸、胆汁酸ステロイドであるリトコール酸がpolβ・8kDaドメインの一本鎖DNA結合活性を阻害したので、阻害剤の8kDaドメインへの結合を^1H-^<15>N HMQC-NMRで解析した。長鎖脂肪酸は8kDaドメインのLeu11,Lys35,His51,Thr79と、リトコール酸はLys60,Leu77,Thr79と結合することを見いだした。長鎖脂肪酸・リトコール酸ともにカルボキシル基を有しており、カルボキシル基がLys残基と水素結合することが考察された。
3.糖脂質(Sulfo-quinovosyl-monoacyl-glycerol, SQMG)の化学合成
長鎖脂肪酸よりも10倍以上強くpolβを阻害する糖脂質(SQMG)の有機化学合成に成功した。また各種類似体・誘導体合成にも成功して、阻害剤の構造活性相関を明らかにした。SQMGと8kDaドメインの結合のNMR解析を現在実施している。
4.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインの変異蛋白質の作製
遺伝子工学的手法を用いて、長鎖脂肪酸およびリトコール酸が結合する上述の8kDaドメインのアミノ酸残基をAlaに変異させた蛋白質の作製に成功した。阻害剤の変異蛋白質への結合について、野生型(非変異型)との比較はこれから実施するところである。
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