藻類の低温環境適応におけるmRNAの構造転移を誘導する蛋白質の構造機能相関の解析

• Project/Area Number: 12780498
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biophysics
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 森田 勇人 愛媛大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (50274303)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2001: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2000: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: RbpAl / 低温環境適応 / RRM / グリシンリッチドメイン / 二本鎖RNA / RNA結合蛋白質 / 多次元NMR分光法 / 円偏光二色性 / ラン藻 / mRNA / 構造転位 / NMR

Research Abstract

本研究では、ラン藻Anabaena variabilis M3株のRNA結合蛋白質RbpAlがRNA分子上に存在する局所的な相補領域間で二次構造を形成するのを防ぐ分子機構を構造科学的に解明することを目的とした。RbpAlは2つの機能単位RRMとグリシンリッチドメインから構成され、安定同位体標識法を併用した多次元NMR分光法によるこれまでの研究結果から、RRMは1枚のベータシートと2本のαヘリックス構造から構成されるのに対し、グリシンリッチドメインは溶液中では明確な二次構造をとらないことを明らかにした。そこで、グリシンリッチをほとんど欠損したRbpAlや部位特異的変異を導入したRbpA1を作製し、そのRNA結合活性と立体構造の相関について、円偏光二色性(CD)スペクトルを測定することで解析した。その結果、グリシンリッチドメインを完全に欠損したRbpAlはRNA結合活性を失うが2アミノ酸残基余分に残したRbpAlでは活性が保持されていた。一方、これらのCDスペクトルにはほとんど差が無かったことから、グリシンリッチドメインのアミノ末端側の領域は、RRMの全体構造の安定化ではなく、RNA分子と直接相互作用する部位の安定化に重要であることが解った。また、ベータシート構造のアミノ末端側のタイロシンやその側鎖の向きを決定していると考えられる46番目のフェニルアラニンに変異を導入しても、RNAの結合活性が大幅に低下したが、必ずしもRRMの二次構造が大きく変化するとは限らなかった。
以上の結果から、RRMの二次構造を維持するのに重要なアミノ酸ならびにRRMがRNA分予を認識するのに重要なアミノ酸残基を同定し、RNA分子と相互作用するRRMの部位を推定した。

Research Products

• [Publications] Y.Tanaka: "Identification of the metal ion binding sites on an RNA motif from hammerhead ribozyme using ^<15>N-NMR spectroscopy"J. Am. Chem. Soc.. (In press). (2002)
• [Publications] A.Kimura: "A high temperature-sensitive mutant of Synechococcus sp. PCC 7942 with modifications in the endogenous plasmid, pAQ1"Plant Cell Physiol.. 43(2). 217-223 (2002)
• [Publications] E.H.Morita: "Studies on the recognition mechanism of DNA sequences with the cyanobacterial transcriptional factor SmtB, sensing zinc-concentration in the cell"J. Inorg. Biochem. 86. 345 (2001)
• [Publications] E.H.Morita: "Studies on the molecular mechanism of the interactions between the cyanobacterial transcription factor, SmtB, and its recognition DNA sequences"Nucleic Acid. Res.. Suppl.1. 251-252 (2001)
• [Publications] Y.Kasai: "Physicochemical analysis of the interaction between a metal ion and the metal-ion-binding motif in hammerhead ribozymes"Nucleic Acid. Res. Suppl.1. 81-82 (2001)
• [Publications] Morlta,E,H.,Murakami,T.,Uegaki,K.,Yamazaki,T.,Sato,N.,Kyogoku,Y.,Hayashi,H.: "NMR backbone assignments of the cold-regulated RNA-binding protein,RbpA1, in the cyanobacterium Anabaena variabills M3.""J.Biomol.NMR. 17. 351-352 (2000)
• [Publications] Tanaka,Y.,Morita,E,H.,Hayashi,H.,Tanaka,T.,Taira,K.: "Well-conserved tandem G-A pairs and the flanking C-G pair in hammerhead ribozymes are sufficient for capture of structurally and catalytically important metal ions.""J.Am.Chem.Soc.. 46. 11303-11310 (2000)