セリンプロテアーゼ、S8の阻害による関節炎発症抑制の検討

• Project/Area Number: 12877021
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General medical chemistry
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 川市 正史 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (00195041)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡 千緒 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (30263445)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 2001: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2000: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
• Keywords: セリンプロテアーゼ / TGF-βファミリー / 変形性骨関節炎 / コラーゲン / 細胞外期質 / フォリスタチン様蛋白質 / 関節炎モデル動物 / 軟骨細胞 / フォリスタチン様ドメイン / セリン蛋白質分解酵素 / 蛋白質分解酵素阻害剤

Research Abstract

(1)正常と関節炎のマウス骨組織におけるS8の発現様式:ウサギで作製した抗マウスS8抗血清をアフィニティーカラムで精製したところ、非常に特異的かつ高感度にS8蛋白質を検出できる抗体が得られた。この抗体による免疫染色の結果、出生後の骨組織ではS8は蛋白質はまず二次骨化中心に現れ、やがて骨基質と関節軟骨の深部の軟骨細胞に検出された。抗コラーゲン抗体とLPSを注射して関節炎を発症させたモデルマウスの関節では、誘導後にS8の発現領域が関節軟骨の深部から浅部へと拡大し、慢性期では関節軟骨表面の破壊部位周囲にS8蛋白質の強い沈着が見られ、関節炎発症との強い関連が示唆された。
(2)抗ヒトS8モノクローナル抗体の作製:ヒトに関節炎の診断と治療を目指し、ヒトのS8に対するIgGモノクローナル抗体を作製した。この抗体を用いてヒト関節の切片を免疫染色したところ、マウスと同様に、関節軟骨細胞に発現が観察された。この抗体を腹水化し大量に産生することに成功した。
(3)S8とTGF-βファミリー増殖因子との結合とシグナル伝達阻害:昆虫細胞とbaculovirusベクターを用いて、マウスS8蛋白質及び各種のS8変異体蛋白質を産生する系を確立し、精製することに成功した。この蛋白質を用いて、S8と種々のTGF-βファミリーとの結合及びシグナル伝達への効果を検討したところ、S8は多様なTGF-β蛋白質と広く結合しそのシグナル伝達を阻害する極めてユニークな活性を持つことが明らかになった。また、TGF-βとの結合にはプロテアーゼドメインが関与することを明らかにした。
(4)S8のプロテアーゼ活性:上記の精製S8蛋白質は蛋白分解活性を保持しており、これをもちいて、S8の自己消化及びカゼイン分解活性を検討し、適切な切断断片を得る条件を設定した。
(5)S8とコラーゲンC-末プロペプチドの結合:S8は蛋白質相互作用に関るPDZドメインを持つため、このドメインに結合する蛋白質を探索し、各種コラーゲンのC-末プロペプチドと結合していることを明らかにした。C-末プロペプチドは、細胞外基質に蓄積しその合成を調節するシグナル因子として働くなど、細胞外基質の機能と密接に関連した生理活性をしており、S8も細胞外基質の合成制御に関る可能性が示唆された。以上の結果の一部は、2001年7月の国際発生生物学会で発表され、論文の投稿準備中である。