SDNFと名づけたシュワン細胞由来神経突起伸長因子の同定・精製と神経修復への応用

• Project/Area Number: 12877230
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Orthopaedic surgery
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 福山 隆一 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (60199271)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伏木 信次 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (80150572) ; 矢追 毅 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (40311914)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2001: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 2000: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: シュワン細胞 / 神経突起 / PC12細胞 / アルブミン / ウォーラー変性 / 神経栄養因子 / PC12 / 末梢神経 / 神経修復 / カラムクロマトグラフィー

Research Abstract

SDNFはマウスシュワン細胞由来IMS32細胞を100μMのアドレナリンで一晩処理した際、その培養液中に現れる物質で、ラット褐色細胞種由来のPC12細胞の神経突起を伸長させる生理活性を持っている。
SDNFが蛋白質かどうかを推定するためにSDNF含有の培養液を37度Cで30分間、0.5、5、50μgのトリプシンで処理し、消化液にトリプシンインヒビターを100μg添加した後、PC12細胞に与えた。コントロールとしてウシ血清アルブミン(BSA)を添加したDMEMを同様に処理したものを用いた。トリプシン50μg以上で処理したコントロールの細胞は抑制が完全ではなく細胞が浮き上がってしまい判定できないが、少なくとも0.5μg処理のものでは著変は見られなかった。この条件で、SDNF含有培養液の活性は消失しなかった。この実験とSDNFの生理活性を消失させるのに100度C、10分間の強い過熱処理が必要であること、アルブミン(BSA)に結合すること、しかも脱脂していないBSAでは細胞にとって毒性効果がでること、などからSDNFは脂質類か、あるいは少なくとも脂質成分を含む可能性が高くなった。カットオフが100kDa、10kDa、3kDaの3種類のセントリコンを用い、遠心法を使って分子量を推定する実験を行った。コントロールとして、アドレナリンを添加していない培養液を用いた。PC12細胞の突起は100kDa以上の分画と10から100kDaの分画で見られたが、前者でより強かった。アルブミンの分子量は約60kDaだから、SDNFの分子量はおそらく40kDa以上と推定された。特異吸光があるかどうかをフェノールレッド不含の培養液にて調製したSDNF含有培養液を190-700nmでスキャンしたが、無刺激の培養液に比べ、刺激した培養液では約360nmにピークを持つ、300-400nmに広がりのあるピークが見られた。
2年間の研究期間にSDNFのさまざまな生化学的性状を明らかにできたが、分離・同定にはいたらなかった。今後さらに解析を続け、SDNFを精製していく予定である。